新疆汉族、维吾尔族散发性乳腺癌患者BRCA1基因甲基化及其临床意义的研究

郭媛媛， 李俊芝， 张　巍

(新疆医科大学第一附属医院病理科， 乌鲁木齐　830054)



·民族肿瘤学·

新疆汉族、维吾尔族散发性乳腺癌患者BRCA1基因甲基化及其临床意义的研究

郭媛媛， 李俊芝， 张巍

(新疆医科大学第一附属医院病理科， 乌鲁木齐830054)

摘要：目的比较新疆地区维吾尔族和汉族散发性乳腺癌患者肿瘤抑制基因BRCA1甲基化水平及其与临床病理特征的关系。方法收集新疆医科大学第一附属医院2004年12月-2014年3月手术切除新鲜组织标本190例，其中维吾尔族、汉族乳腺浸润性导管癌各45例，乳腺良性病变各50例，采用甲基化特异性PCR(MSP)技术检测乳腺癌组织和乳腺良性病变组织中BRCA1基因甲基化状态，荧光定量PCR技术检测BRCA1基因mRNA水平。结果乳腺癌组织中BRCA1基因甲基化检出率明显高于乳腺良性病变组织，差异有统计学意义(P<0.05)。汉族和维吾尔族乳腺癌组织中BRCA1基因甲基化均与乳腺癌组织学分级相关(P<0.05)，且维吾尔族乳腺癌组织BRCA1基因甲基化与月经状况有关(P<0.05)。汉族和维吾尔族患者BRCA1基因甲基化检出率差异无统计学意义(P>0.05)。汉族和维吾尔族患者中甲基化组BRCA1 mRNA表达水平均高于未甲基化组，且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论BRCA1基因甲基化是散发性乳腺癌的重要危险因素,对乳腺癌危险的评估和早期检测具有重要的意义。

关键词：乳腺癌; BRCA1; DNA甲基化; 汉族; 维吾尔族

乳腺癌是女性死亡率较高的疾病。BRCA1乳腺癌易感基因是研究发现的第一个与家族性乳腺癌密切相关的肿瘤抑制基因[1]，位于人染色体17q21，基因全长100 kb，内含41.5%的Alu重复序列和24个外显子，其中含有22个编码外显子以及2个非编码外显子。研究表明，有BRCA1基因突变的乳腺癌患者无论是在同侧还是对侧具有较高的二次复发率[2]。因BRCA1基因的甲基化早于肿瘤恶性表型的出现，所以对乳腺癌早期的诊断提供了新的思路。乳腺癌易感基因结构和功能的异常与散发性及遗传性乳腺癌均具有一定的相关性[3]，40%～45%的遗传性乳腺癌与BRCA1基因突变有关，而散发性乳腺癌患者中却出现BRCA1基因检出率降低的状况，约为8%[4]。

新疆是以维吾尔族和汉族为主的多民族聚集区，由于民族生活习惯和遗传背景的不同，一些恶性肿瘤的发病机制在民族间存在一定的差异。因此，本研究通过检测汉族和维吾尔族散发性乳腺癌患者的癌组织和正常组织中BRCA1基因甲基化水平,探讨BRCA1基因甲基化状态是否存在种族差异及其与临床病理特征的关系。

1资料和方法

1.1标本来源收集新疆医科大学第一附属医院2004年12月-2014年3月手术切除新鲜组织标本190例(获患者知情同意)，其中维吾尔族、汉族乳腺浸润性导管癌各45例，乳腺良性病变各50例。所有患者的HE切片均经过2名病理医师阅片，明确诊断为散发性乳腺癌，无明确肿瘤家族史，术前未接受任何治疗。将甲基化特异性PCR检测试验中的甲基化组随机选取28例(汉族13例及维吾尔族15例)和未甲基化组中随机选取32例(汉族17例及维吾尔族15例)，共计60例研究对象，进行荧光定量PCR检测BRCA1基因mRNA水平。

1.2主要试剂与仪器DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN， 56404)，KAPA 2G 超强PCR试剂盒含dNTPs(KAPA BIOSYSTEMS，KK5516)，TIANScript RT 试剂盒(KR104，Tiangen)，SYBR Select 预混液(4472920，ABI)，RNAprep Pure FFPE Kit(DP439，Tiangen)。实时PCR仪(ABI，USA，7500)，台式高速冷冻离心机(Neofuge 15R，上海力新公司)，电泳槽(北京市六一仪器厂，DYCZ-21)，核酸蛋白定量仪(Nano-100，杭州奥康)。

1.3方法

1.3.1 组织DNA、RNA的提取按照QIAamp DNA FFPE Tissue Kit和RNAprep Pure FFPE Kit操作说明提取总DNA和RNA，使用核酸蛋白定量仪检测RNA浓度，计算A260/A280比值，电泳检测RNA完整性。

1.3.2基因组DNA的亚硫酸氢钠处理在200 μL反应体系中加入1～500 ng DNA 5 μL、RNase-Free H2O 35 μL、亚硫酸盐混合液85 μL、DNA保护溶液15 μL混匀。PCR仪进行DNA转化，反应条件如下：95℃变性5 min，60℃复性25 min，95℃变性5 min，60℃复性1 h 25 min，95℃变性5 min，60℃复性2 h 25 min，后12℃保存。按照说明采用Wizard DNA clean-up system(Promega公司)纯化试剂盒纯化修饰过的DNA。

1.3.3甲基化特异性PCR(MSP)检测BRCA1MSP引物、非甲基化与甲基化特异性引物和目的片段长度见表1。RCR反应液配制体系如下：5×KAPA 2G Buffer 5 μL、5×KAPA Enhancer 15 μL、dNTP Mix(10 mM) 0.5 μL、上游引物(10 μM) 1 μL、下游引物(10 μM) 1 μL、模板 1 μL、KAPA2GRobust Hotstart(5 U/μL) 0.1 μL、dd H2O 211.4 μL。按上述体系在200 μL离心管中配制PCR反应液。配制好的反应体系在PCR仪中按下列反应条件进行扩增：94℃ 5 min 1个循环,94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s重复共35个循环。72℃ 7 min 1个循环，4℃保存。配制3%琼脂糖凝胶，用凝胶成像仪观察并保存结果。

1.3.4荧光定量PCR检测BRCA1基因RNA水平BRCA1及内参照β-actin特异性引物的序列和目的片段长度见表1。cDNA合成：质检合格的RNA样本按下列体系在PCR管配制逆转录反应液条件如下：Total RNA(1～5) μg/Conc, Random 2 μL，超纯DNTP 2 μL，RNase free H2O 1～14.5 μL。后PCR仪上70℃保温5 min后迅速冰上冷却，短暂离心置冰上，加入以下组分：5×Frist-Strand Buffer(含DTT) 4 μL、RNasin 0.5 μL、TIANScript M-MLV 1 μL、Total Volume 5.5 μL，混匀，短暂离心，在PCR仪上42℃温浴50 min，95℃加热5 min，终止反应，置冰上，稀释至50 μL。荧光定量PCR反应体系如下：Forward primer(10 μL)0.4 μL、 Reverse primer(10 μM)0.4 μL、 SYBRR Select Master Mix(2X)10 μL、 cDNA模板， RNase-free water 1～20 μL。ABI7500荧光定量PCR循环条件：UDG Activation AmpliTaq DNA、 50℃、2 min，聚合酶、UP 激活、95℃聚合酶激活2 min，95℃变性15 s，60℃退火，延伸1 min，每个PCR循环重复40次。BRCA1表达水平的相对值=BRCA1光密度值/β-Actin光密度值。

表1　所用引物序列

1.4统计学分析所有统计学分析采用SPSS17.0软件包进行统计,计数资料用卡方或Fisher精确检验分析甲基化与临床病理的相关性，结果均以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1维吾尔族和汉族乳腺癌样本组织中BRCA1基因启动子甲基化状态100例良性病变组织及90例乳腺癌组织中BRCA1基因甲基化检出率分别为6%(6/100)和23%(21/90)，差异有统计学意义(P=0.001，P<0.05)。在汉族95例样本组织中共检测出13例BRCA1基因启动子区甲基化(乳腺癌9例，良性病变4例)，检出率为14%。在维吾尔族95例样本组织中检测出14例BRCA1基因甲基化(乳腺癌12例，良性病变2例)，检出率为15%，汉族及维吾尔族患者BRCA1基因甲基化检出率差异无统计学意义(P=0.835,图1)。图1中维吾尔族良性病变第20例(W20)和乳腺癌患者第36例(W36)及图2中汉族乳腺癌患者第19例(H19)均显示部分甲基化状态，均属于甲基化范畴。

2.2维吾尔族和汉族乳腺癌患者BRCA1基因甲基化与临床病理特征的关系45例汉族乳腺癌患者中，BRCA1基因甲基化与肿瘤组织学分级有关(P=0.028，P<0.05)，与其他临床病理特征均无关(P>0.05)；45例维吾尔族乳腺癌患者中， BRCA1基因甲基化与乳腺癌患者的月经状况和组织学分级有关(P值分别为0.028、0.047)，与年龄和淋巴结转移无关(P>0.05)，见表2。

注: U:未甲基化; M: 甲基化; W17~W23为维吾尔族良性病变的第17~23例患者BRCA1基因甲基化电泳条带;W35~41乳腺癌第35~41例BRCA1基因甲基化电泳条带

图1维吾尔族良性病变、乳腺癌组织中BRCA1甲基化状况

注: U:未甲基化; M: 甲基化; H41~46为汉族良性病变的第41~46例患者BRCA1基因甲基化电永条带。H19~25为乳腺癌组织第19~25例患者BRCA1基因甲基化电泳条带。

图2汉族良性病变、乳腺癌组织中BRCA1甲基化状况

2.3荧光定量PCR检测BRCA1基因mRNA水平汉族和维吾尔族族所抽取样本中未甲基化组均有BRCA1 mRNA表达，甲基化组均出现BRCA1 mRNA低表达或缺失。且未甲基化组与甲基化组BRCA1 mRNA表达的差异均有统计学意义(表3)。

表2　BRCA1基因甲基化与临床病理特征的关系/例(%)

表3　汉族和维吾尔族BRCA1相对表达量(±s, n=30)

注：与未甲基化组比较，△P<0.05。

3讨论

乳腺癌是目前为止对女性健康造成威胁的重要原因。DNA甲基化状态早于肿瘤恶性表型的出现，具有基因和肿瘤组织的异质性[5-6]。BRCA1是重要的肿瘤抑制基因，它的主要功能是调控整个细胞增殖周期的细胞分裂和生长，使细胞按正常程序进行周期性分裂、生长和凋亡[7]，BRCA1基因同时参与细胞的耐药、解毒、代谢、分化以及血管生成。因此，受高甲基化的影响导致抑癌基因或相关基因出现转录活化或关闭，引起细胞增殖失控导致癌变的发生[8]。

近年来，对于乳腺癌基因甲基化的研究也日益增多。Al-Moghrabi 等[9]对155例乳腺癌患者和143例未患癌患者进行研究的结果显示，14.2%乳腺癌患者发生BRCA1甲基化，未患癌患者的甲基化检出率为9.1%，且发现66.7%的甲基化均发生在BRCA1基因启动子区。任婕等[10]对51例散发性乳腺癌患者的BRCA1基因进行MSP检测，结果显示14%的BRCA1基因发生异常甲基化，良性病变中未检测到异常甲基化。本研究发现100例良性病变组织及90例乳腺癌组织中BRCA1基因甲基化检出率分别为6%和23%，且两者差异有统计学意义(P=0.001)。这与上述研究结果具有一致性。Saelee等[11]对61例乳腺癌和45例正常组织中对BRCA1基因甲基化进行检测，结果显示乳腺癌中甲基化率(24.6%)高于正常组织中甲基化检出率(15.6%)；还发现，BRCA1基因甲基化率与肿瘤组织学分级Ⅲ和ⅡB具有明显的相关性(P值分别为0.04、0.02)。本研究结果显示，汉族与维吾尔族乳腺癌患者中BRCA1基因甲基化均与散发性乳腺癌的组织学分级有关(P值分别为0.028、0.047)，这与Saelee等[11]和冯景等[12]的研究观点均具有一致性。同时发现，在维吾尔族乳腺癌患者中，BRCA1甲基化与患者的月经状况有一定的相关性(P=0.028)，但未查到相关文献报道。这可能与实验方法、研究对象的选择以及样本数量较小有关，还需要进行大样本实验来进行验证。

由于抑癌基因BRCA1的失活可以导致细胞周期紊乱，细胞异常增生最终癌变。本研究也从分子水平研究了该基因的缺失与散发性乳腺癌的密切相关性。结果显示在所选的60例样本中，维吾尔族未甲基化组BRCA1mRNA表达量(1.109±0.692)明显高于甲基化组(0.632±0.275)，汉族未甲基化组BRCA1 mRNA表达量(1.223±0.745)也明显高于甲基化组mRNA的表达量(0.695±0.296)，且差异均有统计学意义(P值分别为0.019、0.020)。吴琍等[13]研究显示，30例散发性乳腺癌中，BRCA1基因的甲基化率为43%，且在13例甲基化标本中BRCA1 mRNA水平明显降低，下降率为55%，而未甲基化样本组织中下降率仅为18%,与本实验研究结果具有一致性。

探讨不同种族间BRCA1基因甲基化与乳腺癌之间差异是否具有统计学意义，对临床早期诊断和个性化靶向治疗具有极其重要的意义。虽然本研究结果显示，在95例汉族样本和95例维吾尔族样本中，BRCA1甲基化检出率差异并无统计学意义(P=0.835)。但目前针对新疆地区维吾尔族和汉族BRCA1基因与散发性乳腺癌相关性的研究有限，且不同的实验方法、样本含量及样本组织的选择均会造成不同程度的差异，还需投入大样本更深层次的研究加以对此实验结果进行证实，尽量避免各方面误差，从而对临床不同民族乳腺癌患者提供更精准的个体化治疗。

总之，探讨BRCA1基因甲基化状态与其mRNA表达水平的关系有助于研究散发性乳腺癌的发生、发展机制。由于新疆特殊的人口组成，研究新疆地区不同民族散发性乳腺癌患者与BRCA1基因甲基化的关系也是医学事业发展不可忽视的重要内容。BRCA1基因甲基化可能作为对散发性乳腺癌患者进行诊断和预后评估的肿瘤分子标记物，但还需得到进一步的研究证实。

参考文献:

[1]Boukerroucha M, Josse C, Segers K, et al. BRCA1 germione mutation and glioblastoma development: report of cases[J].BMC Cancer,2015,15:181.

[2]周劼,王恩礼.BRCA1的DNA损伤修复与启动子甲基化的研究进展[J].中华肿瘤防治杂志,2008,15(11):866-869.

[3]宋依凝,魏敏杰,金万宝.乳腺癌易感基因(BRCA)的生物学功能与临床意义[J].现代肿瘤医学,2008,16(11):1992-1994.

[4]Chenevix-Trench G, Healey S, Lakhani S, et al. Genetic and histopathologic evaluation of BRCA1 and BRCA2 DNA sequence variants of an known clinical significance[J]. Cancer Res,2006,66(4):2019-2027.

[5]Tae HK, Barrera L, Zheng M, et al. A high-resolution map of active promoters in the human genome[J].Nature,2005,436(7052):876-880.

[6]Michael W, Davies JJ, David W, et al. Chromosome-wide promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells[J].Nature Genet,2005,37(8)：853-862.

[7]Ralhan R, Kaur J, Kreienberg R, et al. Links between DNA double strand break repair and breast cancer: accumulating evidence from both familial nonfamilial cases[J].Cancer Lett,2007,248(1):1-17.

[8]卓志红,龚朝辉.DNA甲基化与乳腺癌[J]. 癌变·畸变· 突变,2008,20(2):163-165.

[9]Al-Moghrabi N, Nofel A, Al-Yousef N, et al. The molecular significance of methylated BRCA1 promoter in white blood cells of cancer-free females[J].BMC Cancer,2014,14(1):830.

[10]任婕,魏敏杰,金锋等. 散发性乳腺癌组织中BRCA1基因启动子甲基化与蛋白表达的相关性[J].中华肿瘤预防杂志,2007,14(3):161-164.

[11]Saelee P, Chaiwerawattana A, Oqawa K, et al. Cliniaopathogical significance of BRCA1 promoter hypermethylation in Thai breast cancer patients[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014,15(24):10585-10589.

[12]冯景,陶建蜀,汤显冰,等.散发性乳腺癌中BRCA1基因甲基化状况及其与蛋白表达的关系[J].检验医学, 2006,21(6)：642-645.

[13]吴 琍,曹伟红,陈庆峰,等. 散发性乳腺癌中BRCA1基因甲基化状态与其mRNA表达水平的相关研究[J].外科理论与实践，2011,16(6):576-580.

(本文编辑杨晨晨)

Analysis the methylation and clinic significant of BRCA1 gene in Uyghur and Han nationality patients with sporadic breast cancer in Xinjiang

GUO Yuanyuan, LI Junzhi, ZHANG Wei

(DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo analysis the correction between the methylation level of tumor suppressor gene BRCA1 and clinical pathological features in Uighur and Han nationalities patients with sporadic breast cancer in Xinjiang. MethodsFrom December 2004 to Match 2014, 190 cases of fresh tissue were collected as test samples, in which there were 45 Uighur and 45 Han patients′ samples with breast infiltrating ductal carcinoma, 50 Uighur and 50 Han patients′ samples with breast benign lesion . Methylation specific PCR (MSP) technique was used to detect the methylation status of BRCA1 gene in breast cancer tissues and breast benign disease tissues. BRCA1 gene mRNA level was detected by fluorescence quantitative PCR technique. ResultsThe methylation of BRCA1 gene in breast cancer tissues was significantly higher than that in breast benign disease tissues and the difference was statistically significant (P<0.05). The methylation of BRCA1 gene in Han and Uygur patients was related with the histological grade of breast cancer (P<0.05). In addition, the menstrual condition was related to the methylation of BRCA1 gene in Uygur patients (P<0.05). The difference of the relevance ratio of methylation of BRCA1 was not statistically significant (P>0.05). The expression levels of mRNA in methylation group were higher than that of non methylated group between Uighurs and Han nationality, And the difference was statistically significant (P<0.05). ConclusionMethylation of BRCA1 gene was an important risk factor of sporadic breast cancer and has important implications on the assessment and early detection of breast cancer.

Keywords:breast cancer; BRCA1; DNA methylation; Han nationality; Uyghur nationality

[收稿日期：2015-11-01]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.02.007

中图分类号：R655.7; Q344

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)02-0155-05

作者简介：郭媛媛(1988-)，女，在读硕士，研究方向:乳腺癌病理学。通信作者：张巍，女，主任医师,教授,博士生导师,研究方向：肿瘤分子病理学，E-mail:zwyhr100@163.com。

基金项目：新疆维吾尔自治区科技厅科技支疆项目(201291172)