丹参酮ⅡA对脂质运载蛋白2诱导人脐静脉内皮细胞损伤的影响研究

万 强，刘中勇

·论著·

·中医·中西医结合研究·

丹参酮ⅡA对脂质运载蛋白2诱导人脐静脉内皮细胞损伤的影响研究

万 强，刘中勇

目的 探讨丹参酮ⅡA对脂质运载蛋白2(LCN-2)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用及其与细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)信号转导通路的关系。方法 2015年3—5月将HUVEC分为不同浓度组：分别以0、5、10、20 μmol/L LCN-2作用HUVEC 48 h；不同作用时间组：分别以10 μmol/L LCN-2作用HUVEC 0、12、24、48 h；不同药物干预组：对照组(未做任何处理)、LCN-2组(LCN-2 10 μmol/L刺激48 h)、LCN-2+丹参酮ⅡA组(10 μmol/L丹参酮ⅡA预处理HUVEC 1 h后再加10 μmol/L LCN-2刺激48 h)、LCN-2+PD98059组〔PD98059(终浓度20 μmol/L)预处理HUVEC 30 min后再加10 μmol/L LCN-2刺激48 h〕。采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测细胞增殖〔吸光度(A值)〕，流式细胞术检测细胞凋亡，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上清液中白介素6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)表达水平，Western blotting法检测HUVEC中B淋巴细胞癌2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)表达水平。结果 与0 μmol/L组和5 μmol/L组比较，10 μmol/L组、20 μmol/L组A值、Bcl-2表达水平下降，细胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表达水平升高(P<0.05)；与10 μmol/L组比较，20 μmol/L组IL-6、MCP-1表达水平升高(P<0.05)。与0 h组比较，24 h组MCP-1表达水平升高(P<0.05)；与0 h组和24 h组比较，48 h组、72 h组A值、Bcl-2表达水平下降，细胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表达水平升高(P<0.05)；与48 h组比较，72 h组IL-6表达水平升高，Bcl-2、p-ERK1/2表达水平下降(P<0.05)。与对照组比较，LCN-2组、LCN-2+丹参酮ⅡA组、LCN-2+PD98059组A值、Bcl-2表达水平下降，细胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax表达水平升高，LCN-2组及LCN-2+丹参酮ⅡA组p-ERK1/2表达水平升高(P<0.05)；与LCN-2组比较，LCN-2+丹参酮ⅡA组、LCN-2+PD98059组A值、Bcl-2表达水平升高，细胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表达水平下降(P<0.05)；与LCN-2+丹参酮ⅡA组比较，LCN-2+PD98059组A值、p-ERK1/2表达水平下降，细胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、Bax表达水平升高(P<0.05)。结论 丹参酮ⅡA可通过抑制ERK1/2信号转导通路，减轻LCN-2诱导的HUVEC损伤。

丹参酮ⅡA；脂笼蛋白质类；细胞外信号调节MAP激酶类；人脐静脉内皮细胞

万强，刘中勇.丹参酮ⅡA对脂质运载蛋白2诱导人脐静脉内皮细胞损伤的影响研究[J].中国全科医学，2016，19(9)：1086-1090.[www.chinagp.net]

Wan Q，Liu ZY.Effect of tanshinone ⅡA on human umbilical vein endothelial cell injury induced by lipocalin-2[J].Chinese General Practice，2016，19(9)：1086-1090.

脂质运载蛋白2(lipocalin-2，LCN-2)又名中性粒细胞明胶酶脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)，是一种新型脂肪细胞因子。内皮细胞损伤、凋亡是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)进程的起始阶段[1]。研究表明,LCN-2可引起内皮细胞损伤从而促进AS形成[2]。丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA)为唇形科植物丹参的主要脂溶性成分，研究表明,丹参酮ⅡA可从多种途径发挥抗AS效应[3]，但其机制尚未完全阐明。本实验以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)为模型，加用丹参酮ⅡA及细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)信号转导通路特异性阻滞剂PD98059，观察丹参酮ⅡA对LCN-2诱导HUVEC损伤的影响，并探讨其抗AS机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 2015年3—5月，HUVEC购于Cascade Biologics公司，丹参酮ⅡA(纯度≥98%)、二甲基亚砜(DMSO)购于美国Sigma公司，胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司，DMEM培养基购于美国Gibco公司，LCN-2购于美国Acrobiosystems公司，PD98059购于美国Tocris Bioscience公司，Annexin V-FITC试剂盒购于美国Bio Vision公司，白介素6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于美国eBioscience公司，B淋巴细胞癌2(Bcl-2)抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)抗体购于美国Cell Signal Technology公司。

1.2 主要仪器 恒温细胞培养箱、超净台、低温高速离心机、酶标仪购于美国Thermo公司，全自动生化仪购于美国Beckman公司，荧光倒置显微镜购于日本奥林巴斯公司，流式细胞仪购于美国ACEA Biosciences公司，电泳仪购于美国Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 细胞分组及处理 将HUVEC分为不同浓度组：分别以0、5、10、20 μmol/L LCN-2作用HUVEC 48 h[4]。不同作用时间组：分别以10 μmol/L LCN-2作用HUVEC 0、12、24、48 h。不同药物干预组：(1)对照组(未做任何处理)；(2)LCN-2组：LCN-2 10 μmol/L刺激48 h；(3)LCN-2+丹参酮ⅡA组：10 μmol/L丹参酮ⅡA[5]预处理HUVEC 1 h后再加10 μmol/L LCN-2刺激48 h；(4)LCN-2+PD98059组：PD98059(终浓度20 μmol/L[5])预处理HUVEC 30 min后再加10 μmol/L LCN-2刺激48 h。

1.3.2 四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测细胞增殖 HUVEC以1×104/孔接种于96孔板，24 h后撤去血清，分组见1.3.1，每组设6个复孔。干预完成后以20 μl MTT (5 g/L)37 ℃孵育4 h，每孔加DMSO 150 μl低速振荡10 min使结晶物溶解，酶标仪测570 nm处吸光度(A值)。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡 HUVEC以2×105/孔接种于12孔板，24 h后换无血清培养液，培养24 h，分组见1.3.1，每组设6个复孔。收集细胞，加Annexin V-FITC及碘化丙啶(PI)双染，流式细胞术检测细胞凋亡率。

1.3.4 ELISA法检测IL-6、MCP-1表达水平 取对数生长期的HUVEC以1×105/ml接种于培养皿，分组见1.3.1，每组设6个复孔。收集上清液，ELISA法检测上清液中IL-6、MCP-1表达水平，操作步骤参照说明书。

1.3.5 Western blotting法检测Bcl-2、Bax、p-ERK1/2表达水平 分组见1.3.1，每组设6个复孔，提取HUVEC总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，每孔取上清液20 μl加上样缓冲液，100 ℃加热5 min。凝胶电泳转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗(1∶1 000)4 ℃过夜，二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，ECL系统显色，以β-actin为内参，采用Image Tool 3.0进行灰度值分析。

2 结果

2.1 不同浓度及不同作用时间LCN-2对HUVEC的作用 不同浓度组A值、细胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、Bax、p-ERK1/2表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中与0 μmol/L组和5 μmol/L组比较，10 μmol/L组、20 μmol/L组A值、Bcl-2表达水平下降，细胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与10 μmol/L组比较，20 μmol/L组IL-6、MCP-1表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1、图1)。

不同作用时间组A值、细胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、Bax、p-ERK1/2表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中与0 h组比较，24 h组MCP-1表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与0 h组和24 h组比较，48 h组、72 h组A值、Bcl-2表达水平下降，细胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与48 h组比较，72 h组IL-6表达水平升高，Bcl-2、p-ERK1/2表达水平下降，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2、图2)。

2.2 不同药物干预对HUVEC的作用 不同药物干预组A值、细胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、Bax、p-ERK1/2表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中与对照组比较，LCN-2组、LCN-2+丹参酮ⅡA组、LCN-2+PD98059组A值、Bcl-2表达水平下降，细胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax表达水平升高，LCN-2组和LCN-2+丹参酮ⅡA组p-ERK1/2表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与LCN-2组比较，LCN-2+丹参酮ⅡA组、LCN-2+PD98059组A值、Bcl-2表达水平升高，细胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表达水平下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；与LCN-2+丹参酮ⅡA组比较，LCN-2+PD98059组A值、p-ERE1/2表达水平下降，细胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、Bax表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05，见表3、图3)。

表1 不同浓度组A值、细胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、p-ERK1/2、Bax表达水平比较

注：A值=吸光度，IL-6=白介素6，MCP-1=单核细胞趋化蛋白1，Bcl-2=B淋巴细胞癌2，Bax=Bcl-2相关X蛋白，p-ERK1/2=磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2；与0 μmol/L组比较，aP<0.05；与5 μmol/L组比较，bP<0.05；与10 μmol/L组比较，cP<0.05

表2 不同作用时间组A值、细胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、p-ERK1/2、Bax表达水平比较

注：与0 h组比较，aP<0.05；与24 h组比较，bP<0.05；与48 h组比较，cP<0.05

表3 不同药物干预组A值、细胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、p-ERK1/2、Bax表达水平比较

注：LCN-2=脂质运载蛋白2；与对照组比较，aP<0.05；与LCN-2组比较，bP<0.05；与LCN-2+丹参酮ⅡA组比较，cP<0.05

注：p-ERK1/2=磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2，Bax=Bcl-2相关X蛋白，Bcl-2=B淋巴细胞癌2

图1 Western blotting法检测不同浓度组Bcl-2、Bax、p-ERK1/2的表达水平

Figure 1 Levels of Bcl-2,Bax and p-ERK1/2 expression among different concentration groups detected by Western blotting

图2 Western blotting法检测不同作用时间组Bcl-2、Bax、p-ERK1/2的表达水平

Figure 2 Levels of Bcl-2,Bax and p-ERK1/2 expression among different time groups detected by Western blotting

注：LCN-2=脂质运载蛋白2

图3 Western blotting法检测不同药物干预组Bcl-2、Bax、p-ERK1/2的表达水平

Figure 3 Levels of Bcl-2,Bax and p-ERK1/2 expression among different drugintervention groups detected by Western blotting

3 讨论

LCN-2于中性粒细胞中被发现并分离，是脂质运载蛋白家族的2号成员，相对分子量约25 kDa，广泛分布于肾脏、肺脏、肝脏及小肠等多种组织器官中，具有多种生物学功能，在细胞的增殖与凋亡及炎性反应过程中起调节作用[6]。既往对LCN-2的研究主要集中在肾脏病、感染性疾病及肿瘤等方面，近年来研究表明，LCN-2可作为心血管疾病生物标志物，独立预测心血管事件的发生[7]。AS患者血清LCN-2水平显著升高，且与AS严重程度呈正相关[8]，LCN-2水平在AS患者不稳定粥样斑块中亦升高[9]，均提示LCN-2与AS形成密切相关。内皮细胞损伤后释放的炎性因子可致单核细胞黏附迁移、中膜平滑肌细胞增生、泡沫细胞堆积形成脂质斑块，最终促进AS形成[1]。IL-6及MCP-1在AS慢性炎症中扮演重要角色，对巨噬细胞、单核细胞的迁移和激活起调控作用，并能促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)增殖，参与AS形成过程[10]。Bcl-2基因家族蛋白中的促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的比例对细胞凋亡起直接调控作用[11]。Bax可通过与细胞外膜的电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel，VDAC)或细胞内膜的腺苷转位因子(adenine nucleotide translocator，ANT)的结合，介导线粒体膜上的膜通透性孔道的开放，促进细胞凋亡，而Bcl-2可通过与Bax竞争性结合ANT，或直接阻止Bax与VDAC、ANT结合以发挥其抗凋亡效应[12]。本研究结果显示，LCN-2可抑制HUVEC增殖、上调HUVEC内Bax/Bcl-2比例，以促进HUVEC凋亡、诱导分泌IL-6及MCP-1等从而加重HUVEC损伤。

ERK1/2信号转导通路是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)家族分支之一，ERK1/2可通过一系列级联磷酸化将细胞外信号转导至细胞核内，调控HUVEC的多种基因转录，在构建细胞骨架、维持细胞形态、调节细胞增殖及凋亡等生物学进程中起重要作用[13]，该信号转导通路的激活可通过促进VSMC增殖、炎性细胞浸润等促进AS形成[14]。既往研究证实，p-ERK1/2参与了HUVEC中炎性因子表达的调控[15]。本研究结果显示，LCN-2可呈浓度及作用时间依赖性诱导HUVEC中p-ERK1/2表达水平的增加，并诱导分泌炎性因子IL-6及MCP-1，加重HUVEC损伤，提示LCN-2对HUVEC的损伤作用可能与激活ERK1/2信号转导通路有关。

丹参酮ⅡA能通过抗氧化应激、抗炎、调节血脂、抑制平滑肌细胞增殖和迁移、减少巨噬细胞浸润等多种途径发挥抗AS效应[3，16-17]。研究表明，丹参酮ⅡA的抗AS机制与抑制ERK1/2信号转导通路密切相关，丹参酮ⅡA可通过抑制ERK1/2信号转导通路下调c-fos表达水平，显著抑制颈动脉球囊损伤大鼠VSMC增殖并减少血管内膜增生，从而延缓AS进程[18]。但丹参酮ⅡA是否可通过抑制ERK1/2信号转导通路，减轻LCN-2诱导的HUVEC损伤而抗AS尚不清楚。本研究结果证实，丹参酮ⅡA及PD98059均可显著降低HUVEC中p-ERK1/2表达水平、减轻LCN-2诱导的HUVEC增殖抑制、下调Bax/Bcl-2比例以抑制HUVEC凋亡、降低IL-6及MCP-1表达水平，提示丹参酮ⅡA的抗AS机制可能通过抑制ERK1/2信号转导通路，减轻LCN-2诱导的HUVEC损伤得以实现，此发现有望为丹参酮ⅡA在AS防治中的应用提供新依据。丹参酮ⅡA对LCN-2抑制HUVEC增殖、诱导HUVEC凋亡、促进分泌IL-6及MCP-1、调节Bax表达水平的作用强于PD98059，这可能是HUVEC内存在其他信号转导通路，且各信号转导通路间相互作用的结果。丹参酮ⅡA可能也通过其他信号转导通路参与了减轻LCN-2诱导的HUVEC损伤过程。丹参酮ⅡA的抗AS作用机制和临床应用仍需大量基础实验及临床试验研究加以明确。

作者贡献：万强进行实验实施、评估、资料收集、撰写论文、成文、进行质量控制及审校；刘中勇进行实验设计与实施、资料收集整理、并对文章负责。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：陈素芳)

Effect of Tanshinone ⅡA on Human Umbilical Vein Endothelial Cell Injury Induced by Lipocalin-2

WANQiang，LIUZhong-yong.DepartmentofMedicalCardiology，AffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330006，China

Objective To investigate the protective effect of tanshinone ⅡA on human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) injury induced by lipocalin-2 (LCN-2) and its relation with ERK1/2 signal transduction pathway.Methods From March to May in 2015,HUVEC were divided into different concentration groups:(0,5,10 and 20 μmol/L LCN-2 for 48 h),different time groups:(10 μmol/L LCN-2 for 0,12,24 and 48 h) and different drug intervention groups:control group,LCN-2 group (10 μmol/L LCN-2 for 48 h),LCN-2+tanshinone ⅡA group (10 μmol/L tanshinone ⅡA for 1 h then 10 μmol/L LCN-2 for 48 h) and LCN-2+PD98059 group (20 μmol/L PD98059 for 30 min then 10 μmol/L LCN-2 for 48 h).MTT assay was used to detect cell proliferation and flow cytometry was used to detect cell apoptosis;the levels of interleukin-6(IL-6) and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) were determined by enzyme-linked immuno-sorbent assay (ELISA),and the levels of Bcl-2,Bax and p-ERK1/2 in HUVEC were determined by Western blotting.Results Compared with 0 μmol/L group and 5 μmol/L gruop,10 μmol/L group and 20 μmol/L group were significantly lower in A value and the level of Bcl-2 but were significantly higher in apoptosis rate,the levels of IL-6,MCP-1,Bax and p-ERK1/2(P<0.05).Compared 10 μmol/L group,20 μmol/L group was higher in the levels of IL-6 and MCP-1 (P<0.05).Compared with 0 h group,24 h group was higher in the level of MCP-1 (P<0.05).Compared with 0 h group and 24 h group,48 h group and 72 h group were lower in A value and the level of Bcl-2 but were higher in apoptosis rate and the levels of IL-6,MCP-1,Bax and p-ERK1/2 (P<0.05).Compared with 48 h group,72 h group was higher in the level of IL-6 but was lower in the levels of Bcl-2 and p-ERK1/2 (P<0.05).Compared with control group,LCN-2 group,LCN-2+tanshinone ⅡA group and LCN-2+PD98059 group were lower in A value and the level of Bcl-2 but were higher in apoptosis rate and the levels of IL-6,MCP-1,Bax and LCN-2 group,LCN-2+tanshinone ⅡA group were higher in the level of p-ERK1/2 (P<0.05).Compared with LCN-2 group,LCN-2+tanshinone ⅡA group and LCN-2+PD98059 group were higher in A value and the level of Bcl-2 but were lower in apoptosis rate and the levels of IL-6,MCP-1,Bax and p-ERK1/2 (P<0.05).Compared with LCN-2+tanshinone ⅡA group,LCN-2+PD98059 group was lower in A value and the level of p-ERK1/2 but was higher in apoptosis rate and the levels of IL-6,MCP-1,Bcl-2 and Bax(P<0.05).Conclusion Tanshinone ⅡA attenuates HUVEC injury induced by LCN-2 and its mechanism may be related to the inhibition of ERK1/2 signal transduction pathway.

Tanshinone ⅡA；Lipocalins；Extracellular signal-regulated MAP kinases；Human umbilical vein endothelial cells

国家自然科学基金资助项目(81460680)；江西省科技计划资助项目(20135BBG70002)

330006 江西省南昌市，江西中医药大学附属医院心血管病科

刘中勇，330006 江西省南昌市，江西中医药大学附属医院心血管病科；E-mail：liuzhongyong2014@163.com

R 363

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.09.021

2015-06-14；

2016-01-12)