Apelin对单侧输尿管结扎小鼠肾脏纤维化的影响研究

王丽妍，刁宗礼，张启东，张 育，刘文虎

·论著·

Apelin对单侧输尿管结扎小鼠肾脏纤维化的影响研究

王丽妍，刁宗礼，张启东，张 育，刘文虎

目的 探讨生物活性肽Apelin对单侧输尿管结扎(UUO)小鼠肾脏纤维化的影响及相关机制，分析在肾脏纤维化时血清和肾脏局部Apelin/APJ系统的代偿性变化。方法 2014年1月选取7周龄雄性C57Bl/6j小鼠共60只,构建UUO的小鼠模型，并设立假手术组(Sham)作为对照。术后每天给小鼠腹腔注射Apelin-13(0.1 μmol/kg)或等量0.9%氯化钠溶液(vehicle)。根据小鼠手术方式和术后用药情况分为4组(15只/组)：Sham+vehicle组、Sham+Apelin组、UUO+vehicle组、UUO+Apelin组。术后2周将小鼠处死，取手术侧肾脏进行检测。采用Masson染色观察肾脏纤维化程度；采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测肾脏细胞外基质胶原〔纤维连接蛋白(Fibronectin)、Ⅰ型胶原(Collagen I)、Ⅲ型胶原(Collagen Ⅲ)〕表达水平以及肾脏Apelin、APJ表达水平；采用Western blotting法检测肾小管上皮细胞标志物上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、间充质细胞标志物α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平以及转化生长因子β(TGF-β)/Smads信号通路的主要信号分子(TGF-β1、TGF-βR1、p-Smad2)表达水平；采用ELISA法检测小鼠血清Apelin表达水平。结果 4组小鼠肾脏纤维化程度比较，差异有统计学意义(P<0.05)。UUO+vehicle组和UUO+Apelin组小鼠肾脏纤维化程度均高于Sham+vehicle组和Sham+Apelin组(P<0.05)；UUO+Apelin组小鼠肾脏纤维化程度低于UUO+vehicle组(P<0.05)。4组小鼠肾脏Fibronectin、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。UUO+vehicle组和UUO+Apelin组小鼠肾脏Fibronectin、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表达水平高于Sham+vehicle组和Sham+Apelin组(P<0.05)；UUO+Apelin组小鼠肾脏Fibronectin、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表达水平低于UUO+vehicle组(P<0.05)。4组小鼠肾脏E-cadherin、α-SMA表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。UUO+vehicle组和UUO+Apelin组小鼠肾脏E-cadherin表达水平低于Sham+vehicle组和Sham+Apelin组，α-SMA表达水平高于Sham+vehicle组和Sham+Apelin组(P<0.05)；UUO+Apelin组小鼠肾脏E-cadherin表达水平高于UUO+vehicle组，α-SMA表达水平低于UUO+vehicle组(P<0.05)。4组小鼠肾脏TGF-β1、TGF-βR1、p-Smad2表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。UUO+vehicle组和UUO+Apelin组小鼠肾脏TGF-β1 、TGF-βR1、p-Smad2表达水平均高于Sham+vehicle组和Sham+Apelin组(P<0.05)；UUO+Apelin组小鼠肾脏TGF-β1 、TGF-βR1、p-Smad2表达水平均低于UUO+vehicle组(P<0.05)。4组小鼠肾脏Apelin表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)；4组小鼠肾脏APJ、血清Apelin表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。UUO+vehicle组和UUO+Apelin组小鼠肾脏APJ表达水平高于Sham+vehicle组和Sham+Apelin组，血清Apelin表达水平低于Sham+vehicle组和Sham+Apelin组(P<0.05)；UUO+Apelin组小鼠肾脏APJ表达水平低于UUO+vehicle组，血清Apelin表达水平高于UUO+vehicle组(P<0.05)。结论 Apelin通过干扰经典的TGF-β/Smads信号通路抑制UUO小鼠肾脏的肾小管上皮-间充质转分化，进而减轻肾脏纤维化。在肾脏纤维化时，小鼠血清Apelin表达水平降低，肾脏APJ表达水平升高，可能对慢性肾脏病的进展起到一定的代偿作用。

纤维化；肾疾病；肾小管上皮-间充质转分化；小鼠；Apelin

王丽妍，刁宗礼，张启东，等.Apelin对单侧输尿管结扎小鼠肾脏纤维化的影响研究[J].中国全科医学，2016，19(9)：1042-1048.[www.chinagp.net]

Wang LY，Diao ZL，Zhang QD，et al.Effects of Apelin on renal fibrosis in unilateral ureteral obstruction mice[J].Chinese General Practice，2016，19(9)：1042-1048.

肾小管上皮-间充质转分化(EMT)是肾脏纤维化和慢性肾脏病(CKD)进展的重要机制，也是各国学者研究的焦点。转化生长因子β(TGF-β)被认为是触发EMT的主要细胞因子，其能活化Smads、RhoA/ROCK、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)/蛋白激酶B (PKB)、β-catnnin等多条信号通路，其中与肾脏纤维化关系最为密切的是Smads信号通路[1]。

Apelin是一种新发现的生物活性肽，其受体APJ属于G 蛋白偶联受体家族。Apelin/APJ系统在肾脏的各个部位均有分布，参与调节肾脏的正常生理功能[2]。在肾病综合征、糖尿病肾病、高血压肾损害等疾病状态下，其相关分子表达水平会发生改变，但变化趋势不尽相同，可能在一定程度上参与疾病的进展[3]。目前，已有研究证实Apelin和多种器官纤维化之间存在密切联系[4]，但其在肾脏纤维化中的作用尚不清楚。本研究通过建立单侧输尿管结扎(UUO)致肾脏纤维化的小鼠模型，探讨外源性给予Apelin能否抑制经典的TGF-β/Smads信号通路，从而抑制EMT和肾脏纤维化，并明确在肾脏纤维化时，自身Apelin/APJ系统的代偿性变化，为Apelin/APJ系统成为CKD治疗的新靶点提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立 2014年1月选取7周龄雄性c57Bl/6j小鼠60只，体质量为(20±2)g，购于中国医学科学院实验动物研究所。饲养环境：温度(22±1)℃,相对湿度(55±5)%的SPF级动物实验室，自由进食水。

1.2 分组及处理方法 小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉。UUO组于左侧肾脏近肾门处结扎输尿管，再于输尿管远离肾门处做二次结扎。假手术(Sham)组小鼠行左侧输尿管分离术而不结扎，然后关闭腹腔。术后每天给小鼠腹腔注射Apelin-13(0.1 μmol/kg)或等量0.9%氯化钠溶液(vehicle)。最终根据小鼠手术方式和术后用药情况分为4组，15只/组。Sham+vehicle组：小鼠行左侧输尿管分离术，术后每天给予vehicle腹腔注射；Sham+Apelin组：小鼠行左侧输尿管分离术，术后每天给予Apelin-13(0.1 μmol/kg)腹腔注射；UUO+vehicle组：小鼠行左侧输尿管结扎术，术后每天给予vehicle腹腔注射；UUO+Apelin组：小鼠行左侧输尿管结扎术，术后每天给予Apelin-13(0.1 μmol/kg)腹腔注射。术后2周将小鼠处死，取手术侧肾脏，将其横切成3 mm厚的组织块，置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于制作石蜡切片；其余肾脏一半装入冻存管保存于液氮中，用于提取总RNA；另一半装入另一冻存管中保存于-80 ℃冰箱，用于提取组织蛋白。

1.3 Masson染色观察肾脏纤维化程度 肾脏组织经固定、常规脱水、包埋后，切成3 μm厚的切片。将切片脱蜡至水，用5%硫代硫酸钠作用5 min，再用Weiger氏铁苏木素染色5～10 min，然后用1%盐酸乙醇溶液分化，丽春红酸性品红液染色5～10 min。随后用1%磷钼酸水溶液处理约5 min，用苯胺蓝液复染5 min，再用1%冰醋酸溶液处理1 min，95%乙醇溶液脱水多次。最后用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，于光镜下观察，并用图像分析软件对肾脏纤维化程度进行半定量检测。

1.4 实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测肾脏基质胶原和Apelin/APJ系统相关分子表达情况 将肾脏在液氮内研磨，采用Trizol试剂盒(Invitrogen公司，美国)提取总RNA，按说明书进行。反转录采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒(Fermentas公司，加拿大)，按说明书进行。小鼠目的mRNA序列由GenBank获得，引物由上海英骏生物技术有限公司合成(见表1)。RT-PCR反应体系：反转录产物1 μl，前引物、后引物各1 μl (10 pmol/μl)，Power SYBR green PCR Master Mix反应液(Roche公司，瑞士)10 μl，加入去离子水至反应总体积为20 μl。在ABI Prism 7300 RT-PCR仪(Applied Biosystems公司，美国)上设置程序，反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环，以GAPDH作为对照，观察溶解曲线。计算出目的基因的2-ΔΔCt值，最终以各实验组占Sham+vehicle组的百分比表示肾脏基质胶原〔纤维连接蛋白(Fibronectin)、Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ)和Ⅲ型胶原(Collagen Ⅲ)〕表达水平和Apelin、APJ表达水平。

表1 RT-PCR引物序列

注：Fibronectin=纤维连接蛋白，Collagen Ⅰ=Ⅰ型胶原，Collagen Ⅲ=Ⅲ型胶原

1.5 Western blotting法检测肾脏EMT标志物及TGF-β/Smads信号通路相关分子表达情况 将肾脏置于冰上研磨，加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的组织细胞裂解液摇匀，冰浴30 min；在4 ℃ 12 000 r/min下离心30 min(离心半径为10 cm)，取上清液，BCA法测定蛋白表达水平；加上样缓冲液，95 ℃水浴5 min使蛋白变性，取100 μg蛋白行12%聚丙烯酰胺凝胶电脉(SDS-PAGE)，转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司，美国)上，用5%胎牛血清清蛋白(BSA)-PBST封闭1 h。分别用兔抗小鼠α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)多克隆抗体(1∶1 000)、兔抗小鼠上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗体(1∶1 000)、兔抗小鼠TGF-β1多克隆抗体(1∶500)、兔抗小鼠TGF-βRI多克隆抗体(1∶500)(Abcam公司，英国)，兔抗小鼠p-Smad2多克隆抗体(1∶250)、兔抗小鼠Smad2多克隆抗体(1∶500)(Cell Signaling公司，美国)，羊抗小鼠β-actin单克隆抗体(1∶2 000)(Santa Cruz公司，美国)，于4 ℃孵育过夜。用辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3 000)(Santa Cruz公司，美国)于室温下孵育1 h。洗膜后，用ECL法显色并曝光成像。以β-actin作为内参，以各实验组占Sham+vehicle组的百分比表示目的蛋白(肾小管上皮细胞标志物E-cadherin，间充质细胞标志物α-SMA，TGF-β/Smads信号通路相关分子TGF-β1、TGF-βR1、p-Smad2)的表达水平。

1.6 ELISA法检测小鼠血清Apelin表达水平 采用摘眼球取血法，将血液置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管内，加入0.6 U/ml的抑肽酶，于1 500 r/min下离心10 min(离心半径为13.5 cm)，收集上清液。用Apelin ELISA试剂盒(Phoenix公司，德国)检测小鼠血清Apelin表达水平，操作按试剂盒说明书进行。以ng/ml表示小鼠血清Apelin表达水平。

2 结果

2.1 Apelin对小鼠肾脏纤维化的影响 Masson染色显示，Sham+vehicle组和Sham+Apelin组肾脏形态结构基本正常；UUO+vehicle组结扎侧肾脏的肾小管萎缩，肾间质纤维化程度明显；UUO+Apelin组肾脏纤维化程度有所减轻(见图1)。4组小鼠肾脏纤维化程度比较，差异有统计学意义(P<0.05)。UUO+vehicle组和UUO+Apelin组小鼠肾脏纤维化程度均高于Sham+vehicle组和Sham+Apelin组，差异有统计学意义(P<0.05)；UUO+Apelin组小鼠肾脏纤维化程度低于UUO+vehicle组，差异有统计学意义(P<0.05)；Sham+vehicle组和Sham+Apelin组小鼠肾脏纤维化程度比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

2.2 Apelin对小鼠肾脏基质胶原表达的影响 4组小鼠肾脏Fibronectin、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。UUO+vehicle组和UUO+Apelin组小鼠肾脏Fibronectin、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表达水平高于Sham+vehicle组和Sham+Apelin组，差异有统计学意义(P<0.05)；UUO+Apelin组小鼠肾脏Fibronectin、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表达水平低于UUO+vehicle组，差异有统计学意义(P<0.05)；Sham+vehicle组和Sham+Apelin组小鼠肾脏Fibronectin、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表3)。

2.3 Apelin对小鼠EMT的影响 4组小鼠肾脏E-cadherin、α-SMA表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。UUO+vehicle组和UUO+Apelin组小鼠肾脏E-cadherin表达水平低于Sham+vehicle组和Sham+Apelin组，α-SMA表达水平高于Sham+vehicle组和Sham+Apelin组，差异有统计学意义(P<0.05)；UUO+Apelin组小鼠肾脏E-cadherin表达水平高于UUO+vehicle，α-SMA表达水平低于UUO+vehicle组，差异有统计学意义(P<0.05)；Sham+vehicle组和Sham+Apelin组小鼠肾脏E-cadherin、α-SMA表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，见图2、表4)。

表2 4组小鼠肾脏纤维化程度比较±s，%)

注：Sham=假手术，vehicle=0.9%氯化钠溶液，UUO=单侧输尿管结扎；与Sham+vehicle组比较，aP<0.05；与Sham+Apelin组比较，bP<0.05；与UUO+vehicle组比较，cP<0.05

Table 3 Comparison of renal matrix collagen expression of mice among the four groups

组别只数FibronectinCollagenⅠCollagenⅢSham+vehicle组15100010001000Sham+Apelin组151096±1821174±2791059±145UUO+vehicle组153074±175ab8111±410ab6090±317abUUO+Apelin组152061±224abc4887±348abc3252±268abcF值99360376060358200P值<0001<0001<0001

注：与Sham+vehicle组比较，bP<0.05；与Sham+Apelin组比较，bP<0.05；与UUO+vehicle组比较，cP<0.05

注：Sham=假手术，vehicle=0.9%氯化钠溶液，UUO=单侧输尿管结扎

图1 光镜下各组小鼠肾脏纤维化程度(Masson染色，×40)

Figure 1 Degree of renal fibrosis of mice in each group observed by light microscope

注：E-cadherin=上皮细胞钙黏蛋白，α-SMA=α平滑肌肌动蛋白

图2 Western blotting法检测肾脏EMT标志物表达水平电泳图

Figure 2 Electrophoretogram of the expression of renal EMT markers detected by Western blotting method

Table 4 Comparison of the expression of renal EMT markers of mice among the four groups

组别只数E-cadherinα-SMASham+vehicle组1510001000Sham+Apelin组151088±871164±179UUO+vehicle组15623±84ab3657±214abUUO+Apelin组15825±40abc1877±207abcF值30980146900P值<0001<0001

注：与Sham+vehicle组比较，aP<0.05；与Sham+Apelin组比较，bP<0.05；与UUO+vehicle组比较，cP<0.05；E-cadherin=上皮细胞钙黏蛋白，α-SMA=α平滑肌肌动蛋白

2.4 Apelin对小鼠肾脏TGF-β/Smads信号通路的影响 4组小鼠肾脏TGF-β1、TGF-βR1、p-Smad2表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。UUO+vehicle组和UUO+Apelin组小鼠肾脏TGF-β1、TGF-βR1、p-Smad2表达水平均高于Sham+vehicle组和Sham+Apelin组，差异有统计学意义(P<0.05)；UUO+Apelin组小鼠肾脏TGF-β1、TGF-βR1、p-Smad2表达水平均低于UUO+vehicle组，差异有统计学意义(P<0.05)；Sham+vehicle组和Sham+Apelin组小鼠肾脏TGF-β1、TGF-βR1、p-Smad2表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，见图3、表5)。

2.5 Apelin对小鼠肾脏Apelin/APJ系统及血清Apelin表达水平的影响 4组小鼠肾脏Apelin表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)；4组小鼠肾脏APJ、血清Apelin表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。UUO+vehicle组和UUO+Apelin组小鼠肾脏APJ表达水平高于Sham+vehicle组和Sham+Apelin组，血清Apelin表达水平低于Sham+vehicle组和Sham+Apelin组，差异有统计学意义(P<0.05)；UUO+Apelin组小鼠肾脏APJ表达水平低于UUO+vehicle组，血清Apelin表达水平高于UUO+vehicle，差异有统计学意义(P<0.05，见表6)。

注：TGF-β=转化生长因子β

图3 Western blotting法检测肾脏TGF-β/Smads信号通路相关分子表达水平电泳图

Figure 3 Electrophoretogram of TGF-β/Smads signal path molecules expression detected by Western blotting method

Table 5 Comparison of renal TGF-β/Smads signaling pathway molecules expression of mice among the four groups

组别只数TGF⁃β1TGF⁃βR1p-Smad2Sham+vehicle组15100010001000Sham+Apelin组151144±75986±871062±132UUO+vehicle组153918±224ab4690±161ab2430±243abUUO+Apelin组152104±140abc2597±292abc1487±176abcF值28789033275048790P值<0001<0001<0001

注：TGF-β=转化生长因子β；与Sham+vehicle组比较，aP<0.05；与Sham+Apelin组比较，bP<0.05；与UUO+vehicle组比较，cP<0.05

Table 6 Comparison of the expression of renal Apelin/APJ system related molecules and serum Apelin of mice among the four groups

组别只数肾脏Apelin(%)肾脏APJ(%)血清Apelin(ng/ml)Sham+vehicle组1510001000069±013Sham+Apelin组15950±2471769±1318071±011UUO+vehicle组15715±18319580±3387ab028±010abUUO+Apelin组15828±16010727±3137abc049±007abcF值16403975011540P值0260<0001<0001

注：与Sham+vehicle组比较，aP<0.05；与Sham+Apelin组比较，bP<0.05；与UUO+vehicle组比较，cP<0.05

3 讨论

作为一种新近发现的多肽，Apelin及其受体APJ具有广泛的生物学效应，参与调节多种器官的生理功能，同时也和疾病的发生、发展密切相关[3]。目前，大量研究表明Apelin能促进肝脏纤维化的发生[4]。有学者在胆管闭锁致肝脏纤维化患者的肝脏局部观察到了Apelin/APJ系统的异常活化，且Apelin的表达水平与肝脏纤维化的程度呈正相关[3]。体外实验表明，Apelin能促进肝星状细胞分泌细胞外基质，并能激活炎性反应，促进血管的形成[4]。动物实验显示，对肝脏纤维化的大鼠注射APJ受体拮抗剂，可以减轻肝脏纤维化程度[5]。然而与上述效应相反，在心血管系统中Apelin被视为是抗纤维化的细胞因子，如有研究显示，对肺动脉高压大鼠注射Pyr-Apelin13可以减少促纤维化细胞因子〔内皮素1(ET-1)、血管紧张紧Ⅱ(Ang Ⅱ)〕的分泌，改善右心功能[6]。有学者发现，Apelin可以在一定程度上抑制AngⅡ诱导的纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)的表达，从而改善心肌纤维化[7]。也有研究显示，Apelin能抑制TGF-β介导的心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化过程[8]。因此，Apelin对器官纤维化具有双向调节作用，在不同组织器官中其作用机制也不相同。然而关于Apelin和肾脏纤维化之间的关系目前尚无明确报道。

在本研究中，笔者建立了UUO致肾脏纤维化的小鼠模型，该模型是研究非免疫性肾间质损伤的成熟动物模型。建模2周后观察到UUO小鼠结扎侧肾脏出现明显的肾小管萎缩、肾间质纤维化和基质胶原的沉积，而每日腹腔注射Apelin能显著减轻上述表现，提示Apelin在整体水平具有一定的抗肾脏纤维化作用。通过对肾小管上皮细胞标志物E-cadherin和间充质细胞标志物α-SMA的检测发现，UUO小鼠的肾脏有明显的EMT改变，而腹腔注射Apelin能显著减轻这一过程。随后，又对引起EMT的经典信号通路(TGF-β/Smads信号通路)进行检测，结果显示UUO小鼠结扎侧肾脏的TGF-β1和TGF-βR1以及活化型Smad即p-Smad2的表达水平均高于Sham组，提示TGF-β/Smads信号通路被激活，这与以往的研究结果一致[9]。而外源性给予Apelin可以显著下调上述相关分子的表达水平。该结果从整体水平证实了Apelin对TGF-β/Smads信号通路的抑制作用。但对于Apelin/APJ系统活化后如何与TGF-β/Smads信号通路发生关联本研究并未涉及，尚需进一步实验加以明确。

通过对小鼠血清和肾脏局部Apelin/APJ系统的检测发现，UUO小鼠血清Apelin表达水平低于Sham组，而肾脏APJ的表达水平却显著升高。推测肾脏APJ表达水平的上调可能是对血清Apelin表达水平降低的一种代偿性反应。对维持性血液透析患者的研究提示，尿毒症毒素对血管内皮细胞的损伤，导致Apelin合成减少，可能是引起透析患者血清Apelin表达水平低于正常人的原因[10]。这也可以部分解释UUO小鼠血清Apelin表达水平降低的原因。既往已有关于肾脏疾病时Apelin/APJ系统相关分子表达水平变化的报道[11-12]。在肾病综合征大鼠体内，检测到肾脏和血浆Apelin表达水平升高，同时发现其尿蛋白水平与肾脏Apelin表达水平呈正相关[11]。对于肾性高血压大鼠，观察到其血浆Apelin表达水平是降低的，且肾脏APJ的表达水平有所减少[12]。针对1型糖尿病小鼠的研究显示，其肾脏APJ的表达水平降低，外源性给予Apelin可以使肾脏 APJ的表达水平有所恢复[13]。尽管上述研究结果与本研究结果并不完全一致，但仍提示Apelin/APJ系统参与肾脏疾病的发生和发展。在心血管领域也有关于Apelin/APJ系统代偿性变化的报道。对心力衰竭患者及相关动物模型的研究显示，在心力衰竭早期血清Apelin表达水平代偿性升高，这是由于Apelin具有较强的正性肌力作用，可以暂时缓解心功能降低所引起的临床症状，但到了心力衰竭晚期血清Apelin表达水平则低于正常[6]。由此推测，在肾脏纤维化的早期Apelin/APJ系统可能也起到一定的代偿作用，但该作用是有限的，随着疾病的进展，Apelin和APJ的表达水平受到多种因素的影响，其变化趋势也不尽相同。由于人体是十分复杂的有机体，特别是在CKD状态下，影响Apelin/APJ系统相关因子表达水平和其功能的因素众多，因此仅凭单一的动物模型无法完全了解其与疾病发生和发展之间的关系，尚需大样本量的临床研究来进一步观察。

综上所述，本研究证实了Apelin可以通过直接抑制经典的TGF-β/Smads信号通路而抑制EMT，进而起到减轻肾脏纤维化的作用。在肾脏纤维化时，血清Apelin表达水平降低，肾脏APJ表达水平升高，可能对CKD的进展起到一定的代偿作用。

作者贡献：王丽妍负责实验实施、资料收集整理、撰写论文；刁宗礼、张启东、张育进行实验实施、评估、资料收集；刘文虎进行实验设计并对文章负责。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：李婷婷)

Effects of Apelin on Renal Fibrosis in Unilateral Ureteral Obstruction Mice

WANGLi-yan,DIAOZong-li,ZHANGQi-dong,etal.DepartmentofNephrology,AffiliatedBeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China

Objective To investigate the effect of biological active peptide Apelin and its mechanism and analyze the compensatory change of partial Apelin/APJ system of serum and kidney in the process of renal fibrosis in unilateral ureteral obstruction(UUO) mice.Methods In January 2014,a total of 60 seven-week-old male C57Bl/6j mice were selected.We established mice models of UUO and made Sham operated mice as controls.After surgery,intraperitoneal injection of Apelin-13(0.1 μmol/kg) or the same amount of 0.9% sodium chloride solution(vehicle) was administrated on mice everyday.The mice were divided into four experimental groups (15 mice/group) according to operation mode and postoperative drug administration:Sham+vehicle group,Sham+Apelin group,UUO+vehicle group and UUO+Apelin group.Two weeks after surgery,mice were killed and the operative kidneys were taken for various tests.Masson′s trichrome staining was performed to evaluate the extent of renal fibrosis.RT-PCR analysis was performed to evaluate the expression of kidney extracellular matrix collagens,including Fibronectin,Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ,as well as the expression of Apelin and APJ in kidneys.Western blotting method was performed to determine the expression of E-cadherin and α-SMA,as well as the expression of TGF-β/Smads signaling molecules TGF-β1,TGF-βR1,and p-Smad2.ELISA method was performed to determine the expression of Apelin in serum.Results The 4 groups were significantly different in the degree of renal fibrosis (P<0.05).UUO+vehicle group and UUO+Apelin group were higher than Sham+vehicle group and Sham+Apelin group in the degree of renal fibrosis(P<0.05);UUO+Apelin group was lower than UUO+vehicle group in the degree of renal fibrosis(P<0.05).The 4 groups were significantly different in the expression of Fibronectin,CollagenⅠand Collagen Ⅲ(P<0.05).UUO+vehicle group and UUO+Apelin group were higher than Sham+vehicle group and Sham+Apelin group in the expression of Fibronectin,CollagenⅠ and Collagen Ⅲ in kidney(P<0.05);UUO+Apelin group was lower than UUO+vehicle group in the expression of Fibronectin,CollagenⅠ and Collagen Ⅲ(P<0.05).The 4 groups were significantly different in the expression of E-cadherin and α-SMA in kidney(P<0.05).UUO+vehicle group and UUO+Apelin group were lower in the expression of E-cadherin and higher in the expression of α-SMA than Sham+vehicle group and Sham+Apelin group (P<0.05);UUO+Apelin group was higher in the expression of E-cadherin and lower in the expression of α-SMA than UUO+vehicle group (P<0.05).The 4 groups were significantly different in the expression of TGF-β1,TGF-βR1 and p-Smad2 (P<0.05).UUO+vehicle group and UUO+Apelin group were higher than Sham+vehicle group and Sham+Apelin group in the expression of TGF-β1 、TGF-βR1、p-Smad2 (P<0.05);UUO+Apelin group was lower than UUO+vehicle group in the expression of TGF-β1,TGF-βR1,p-Smad2 (P<0.05).The 4 groups were significantly different in the expression of Apelin in kidney (P>0.05);the 4 groups were significantly different in the expression of APJ in kidney and Apelin in serum (P<0.05).UUO+vehicle group and UUO+Apelin group were higher in the expression of APJ in kidney and lower in the expression of Apelin in serum than Sham+vehicle group and Sham+Apelin group (P<0.05);UUO+Apelin group was lower in the expression of APJ in kidney and higher in the expression of Apelin in serum than UUO+vehicle group(P<0.05).Conclusion Apelin is able to inhibit epithelial-mesenchymal transdifferentitation in UUO mice by interfering TGF-β/Smads signal pathway,thus alleviating renal fibrosis.During the process of renal fibrosis,the expression of serum Apelin decreases and the expression of kidney APJ increases in mice,which may have certain compensatory effect on the development of chronic kidney diseases.

Fibrosis；Kidney diseases；Epithelial-mesenchymal transdifferentiation；Mice；Apelin

国家自然科学基金资助项目(81570660，81300607)；北京市自然科学基金课题(7132091)

100050北京市，首都医科大学附属北京友谊医院肾内科

刘文虎，100050北京市，首都医科大学附属北京友谊医院肾内科；E-mail:liuwh0211@126.com

R 692

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.09.012

2015-08-29；

2015-12-26)