Rad对心肌营养素1诱导心肌细胞肥大作用的实验研究

刘玉峰，耿召华，牛丽丽

·论著·

Rad对心肌营养素1诱导心肌细胞肥大作用的实验研究

刘玉峰，耿召华，牛丽丽

目的 探讨小G蛋白Rad对心肌营养素1(CT-1)诱导心肌细胞肥大作用的影响。方法 2011年6月—2013年3月，选取新生健康雄性SD乳鼠60只。构建载有Rad基因的腺病毒载体(Ad-Rad)、含有编码绿色荧光蛋白基因的空白腺病毒载体(Ad-GFP)。取乳鼠心脏并剪碎，进行心肌细胞原代培养。采用随机数字表法将提取的原代心肌细胞平均分为6组，即空白对照组〔转染磷酸盐缓冲液(PBS)，刺激物为PBS〕、Ad-GFP组(转染Ad-GFP，刺激物为PBS)、Ad-Rad组(转染Ad-Rad，刺激物为PBS)、CT-1对照组(转染PBS，刺激物为CT-1)、Ad-GFP+CT-1组(转染Ad-GFP，刺激物为CT-1)、Ad-Rad+CT-1组(转染Ad-Rad，刺激物为CT-1)。转染腺病毒载体48 h后，采用流式细胞仪检测腺病毒载体转染率，并采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测Rad、心房钠因子(ANF)、β肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA表达水平，Western blotting法检测Rad表达水平。结果 腺病毒载体转染率为95.51%。Ad-Rad组Rad mRNA表达水平高于空白对照组、Ad-GFP组、CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1组Rad mRNA表达水平高于空白对照组、Ad-GFP组、CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组(P<0.05)。CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组ANF mRNA表达水平高于空白对照组、Ad-GFP组、Ad-Rad组(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1组ANF mRNA表达水平低于空白对照组、Ad-GFP组、Ad-Rad组、CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组(P<0.05)。CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组β-MHC mRNA表达水平高于空白对照组、Ad-GFP组、Ad-Rad组(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1组β-MHC mRNA表达水平低于CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组(P<0.05)。Ad-Rad组Rad表达水平高于空白对照组、Ad-GFP组、CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1组Rad表达水平高于空白对照组、Ad-GFP组、CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组(P<0.05)。结论 Rad具有负性调节CT-1诱导心肌细胞肥大的作用。

肥大；肌细胞,心脏；Rad；心肌营养素1；腺病毒

刘玉峰，耿召华，牛丽丽.Rad对心肌营养素1诱导心肌细胞肥大作用的实验研究[J].中国全科医学，2016，19(9)：1032-1036.[www.chinagp.net]

Liu YF,Geng ZH,Niu LL.Effect of Rad on myocardial cells hypertrophy induced by cardiotrophin-1[J].Chinese General Practice，2016，19(9)：1032-1036.

Rad(Ras associated with diabetes)是新近发现的小G蛋白，属于RGK亚家族成员之一[1-2]。在心血管疾病中，小G蛋白对血管内皮细胞的功能、血管平滑肌细胞的收缩、增殖、迁移以及心肌细胞肥大与凋亡的发生均具有调节作用[3]。Chang等[4]首次报道，小G蛋白Rad缺乏易导致心肌细胞肥大。但是Rad是否具有负性调节心肌营养素1(cardiotrophin-1，CT-1)诱导心肌细胞肥大作用的研究国内外鲜见报道，故本研究以CT-1作为促心肌细胞肥大刺激因子，以心房钠因子(atrialnatriuretic factor，ANF)、β肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA表达水平作为心肌细胞肥大指标，研究Rad过表达对心肌细胞肥大过程中细胞内ANF、β-MHC mRNA表达水平的影响，以探讨Rad是否具有负性调节CT-1诱导心肌细胞肥大的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2011年6月—2013年3月，选取新生健康雄性SD乳鼠60只，体质量约20 g，鼠龄1～2 d，由第三军医大学第二附属医院实验动物中心提供(许可证号：SYXK-军2012-0011)。

1.2 主要试剂及设备 流式细胞仪(Beckman Coulter公司)，高糖DMEM培养基(HyClone公司)，CT-1(Gibico公司)，反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒(Takara公司)，Rad抗体(Santa Cruz公司)，荧光显微镜(Olympus公司)，实时荧光定量PCR仪(ABI 7500)。

1.3 研究方法

1.3.1 构建缺陷腺病毒载体 构建载有Rad基因的腺病毒载体(Ad-Rad)、含有编码绿色荧光蛋白基因的空白腺病毒载体(Ad-GFP)。

1.3.2 心肌细胞原代培养 取出新生SD乳鼠心脏并剪碎，采取分步消化法提取心肌细胞悬液，纯化心肌细胞，用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基置入CO2

本研究背景：

Rad是新近发现的小G蛋白，其生物学功能非常广泛，包括参与细胞增殖、迁移，细胞骨架重排，细胞内囊泡的转运以及肿瘤癌基因的调节等。人类Rad基因在心血管系统的心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞中均有表达，在骨骼肌、心脏和肺脏中表达水平较高。研究报道，小G蛋白Rad功能缺乏易导致心肌细胞肥大，提示Rad可能参与心肌细胞肥大的进展。

培养箱于37 ℃培养。

1.3.3 实验分组及其处理方法 采用随机数字表法将提取的原代心肌细胞平均分为6组，即空白对照组〔转染磷酸盐缓冲液(PBS)，刺激物为PBS〕、Ad-GFP组(转染Ad-GFP，刺激物为PBS)、Ad-Rad组(转染Ad-Rad，刺激物为PBS)、CT-1对照组(转染PBS，刺激物为CT-1)、Ad-GFP+CT-1组(转染Ad-GFP，刺激物为CT-1)、Ad-Rad+CT-1组(转染Ad-Rad，刺激物为CT-1)。转染腺病毒载体48 h后，荧光显微镜下观察，用PBS清洗3遍，加入不含胎牛血清的高糖DMEM培养基，饥饿心肌细胞24 h，各组分别加入刺激物，培养48 h，PBS清洗3遍，裂解细胞并收集裂解细胞液。

1.3.4 检测腺病毒载体转染率 调整感染复数(multiplicity of infection，MOI)为20，分别转染Ad-GFP、Ad-Rad腺病毒，48 h后，在激光共聚焦显微镜下观察转染效果，并采用流式细胞仪检测腺病毒载体转染率。1.3.5 RT-PCR法检测Rad、ANF、β-MHC mRNA表达水平 按RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，设计Rad、ANF、β-MHC mRNA的引物：Rad上游引物为5′-CGCATCTTTGGTGGAGTAGAA-3′，下游引物为5′-GCCCTTGTCCGTTATTGAGTA-3′，产物长度为201 bp；ANF上游引物为5′-AGGAGAAGATGCCGGTAGAG-3′，下游引物为5′-AGAGCCCTCAGTTTGCTTTCTT-3′，产物长度为211 bp；β-MHC上游引物为5′-TCCAGAAGAGAAGAACTCCATTT-3′，下游引物为5′-ATACTCGTTGCCCACTTTGACTAAT-3′，产物长度为205 bp。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参照，其上游引物为5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物为5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACT-3′，产物长度为252 bp。采用实时荧光定量PCR仪计算基因相对表达水平，空白对照组mRNA表达水平设定为1。实验共重复3次，取平均值。1.3.6 Western blotting法检测Rad表达水平 裂解各组心肌细胞，提取总蛋白，调整蛋白上样量，使各组蛋白上样量相等，在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，然后转移至聚偏二氟乙烯膜，5%胎牛血清清蛋白封闭1 h，用Rad一抗与聚偏二氟乙烯膜结合孵育过夜。洗膜后与辣根过氧化物酶标记的Rad二抗结合，室温孵育1 h，经化学发光法显像。采用ODYSSEY 13.0扫描仪对胶片扫描成像，用Quantity One软件对图像进行吸光度分析，以目的条带与内参条带信号强度比值代表心肌细胞中Rad表达水平。实验共重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 腺病毒载体转染率 腺病毒载体转染率为95.51%(见图1～3，本文图1、2彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。

图1 倒置显微镜下心肌细胞(×100)

本研究创新点：

以腺病毒为目的基因的载体转染心肌细胞，心肌营养素1(CT-1)作为促心肌细胞肥大刺激因子，心房钠因子(ANF)、β肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA表达水平作为心肌细胞肥大指标，研究Rad过表达对心肌细胞肥大过程中细胞内ANF、β-MHC mRNA表达水平的影响，以探讨Rad是否具有负性调节CT-1诱导心肌细胞肥大的作用。为探索Rad负性调节CT-1诱导心肌细胞肥大的分子机制提供重要线索，从而为心肌肥厚在临床治疗方面的研究提供了新的策略。

图2 荧光显微镜下心肌细胞(×100)

图3 流式细胞仪检测腺病毒载体转染率结果

2.2 各组Rad、ANF、β-MHC mRNA表达水平比较 各组Rad mRNA表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。Ad-Rad组Rad mRNA表达水平高于空白对照组、Ad-GFP组，差异有统计学意义(P<0.05)；CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组Rad mRNA表达水平低于Ad-Rad组，差异有统计学意义(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1组Rad mRNA表达水平高于空白对照组、Ad-GFP组、CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

各组ANF mRNA表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组ANF mRNA表达水平高于空白对照组、Ad-GFP组、Ad-Rad组，差异有统计学意义(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1组ANF mRNA表达水平低于空白对照组、Ad-GFP组、Ad-Rad组、CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

各组β-MHC mRNA表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组β-MHC mRNA表达水平高于空白对照组、Ad-GFP组、Ad-Rad组，差异有统计学意义(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1组β-MHC mRNA表达水平低于CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table 1 Comparison of mRNA expression levels of Rad,ANF and β-MHC among each group

组别RadmRNAANFmRNAβ⁃MHCmRNA空白对照组100±000100±000100±000Ad⁃GFP组098±005100±006096±019Ad⁃Rad组330±015ab107±008080±009CT⁃1对照组100±002c140±010abc246±020abcAd⁃GFP+CT⁃1组103±005c138±004abc204±016abcAd⁃Rad+CT⁃1组327±015abde085±003abcde080±004deF值5022903879337086P值<0001<0001<0001

注：Ad-GFP=含有编码绿色荧光蛋白基因的空白腺病毒载体，Ad-Rad=载有Rad基因的腺病毒载体，CT-1=心肌营养素1，ANF=心房钠因子，β-MHC=β肌球蛋白重链；与空白对照组比较，aP<0.05；与Ad-GFP组比较，bP<0.05；与Ad-Rad组比较，cP<0.05；与CT-1对照组比较，dP<0.05；与Ad-GFP+CT-1组比较，eP<0.05

2.3 各组Rad表达水平比较 各组Rad表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。Ad-Rad组Rad表达水平高于空白对照组、Ad-GFP组，差异有统计学意义(P<0.05)；CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组Rad表达水平低于Ad-Rad组，差异有统计学意义(P<0.05)；Ad-Rad+CT-1组Rad表达水平高于空白对照组、Ad-GFP组、CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表2 各组Rad表达水平比较

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与Ad-GFP组比较，bP<0.05；与Ad-Rad组比较，cP<0.05；与CT-1对照组比较，dP<0.05；与Ad-GFP+CT-1组比较，eP<0.05

3 讨论

Rad是新近发现的小G蛋白，是Maguire等[5]通过消减克隆方法在2型糖尿病患者的骨骼肌细胞中发现的，属于RGK亚家族成员之一，该家族成员还包括Gem/kir、Rem、Rem2。人类Rad基因位于16号染色体q12[2]。Rad分子量为33～35 KDa[5-6]。小G蛋白家族均拥有一个共同的酶域，含170个氨基酸残基，5个保守氨基酸序列，参与酶的结构域与三磷酸核苷的识别、结合、水解、分离作用[7]。Rad的生物学功能非常广泛，包括参与细胞增殖、迁移，细胞骨架重排，细胞内囊泡的转运以及肿瘤癌基因的调节等[8-10]。人类Rad基因在心血管系统的心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞中均有表达，在骨骼肌、心脏和肺中表达水平较高[1-2,10]，这提示Rad可能参与心血管疾病的进展过程。Chang等[4]首次报道，小G蛋白Rad功能缺乏易导致心肌细胞肥大。然而，小G蛋白Rad是否具有负性调节CT-1诱导心肌细胞肥大作用的研究尚未见报道。CT-1最初是从心脏分离出的细胞因子，在心肌细胞凋亡、肥大中发挥重要作用，在体外可诱导心肌细胞肥大[11]。本研究利用腺病毒介导转基因技术，在体外培养的乳鼠心肌细胞中过表达Rad基因，以CT-1作为促心肌细胞肥大刺激因子，以ANF、β-MHC mRNA表达水平作为心肌细胞肥大指标，结果显示，腺病毒载体转染率为95.51%，提示心肌细胞虽然为终末分化细胞，但通过同源重组构建携带Rad目的基因的腺病毒载体，转染原代培养的心肌细胞，可以高效地将目的基因Rad导入细胞内。Ad-Rad组Rad mRNA及其蛋白表达水平高于空白对照组、Ad-GFP组、CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组，Ad-Rad+CT-1组Rad mRNA及其蛋白表达水平高于空白对照组、Ad-GFP组、CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组；CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组ANF mRNA表达水平高于空白对照组、Ad-GFP组、Ad-Rad组，Ad-Rad+CT-1组ANF mRNA表达水平低于空白对照组、Ad-GFP组、Ad-Rad组、CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组；CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组β-MHC mRNA表达水平高于空白对照组、Ad-GFP组、Ad-Rad组，Ad-Rad+CT-1组β-MHC mRNA表达水平低于CT-1对照组、Ad-GFP+CT-1组。表明Rad过表达对CT-1所诱导的心肌细胞肥大具有抑制作用，提示Rad具有负性调节CT-1诱导心肌细胞肥大的作用。

目前，对Rad负性调节CT-1诱导心肌细胞肥大的机制尚未完全阐明。研究显示，Rad作为一种新型的内源性调节因子，其与L-型钙通道β亚单位相结合，调节电压依赖型L-型钙通道功能，调节心脏兴奋收缩偶联、肾上腺素受体信号传导通路和抑制心律失常[2-3,12]。Chang等[4]利用肾上腺素刺激培养的乳鼠心肌细胞时发现，缺失Rad功能的心肌细胞在肾上腺素刺激下，更容易发生心肌细胞肥大，这表明Rad是一种新型的调节因子，其可能是通过激活(磷酸化)的钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)途径负性调节CT-1诱导心肌细胞肥大的。这些研究为探索Rad负性调节CT-1诱导心肌细胞肥大的分子机制提供重要线索，从而为心肌肥厚在临床治疗方面的研究提供了新的策略。然而其具体分子机制还需要进一步研究。

本研究并未检测肥大基因ANF、β-MHC表达水平，可能对结果有一定影响，今后将进一步完善。

综上所述，Rad具有负性调节CT-1诱导心肌细胞肥大的作用。本研究结论为探索Rad负性调节CT-1诱导心肌细胞肥大的分子机制提供了重要线索，从而为心肌肥厚临床治疗方面的研究提供了新的策略。

作者贡献：刘玉峰进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；耿召华、牛丽丽教授指导标书及论文的书写，并对文章质量进行控制及审效。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：崔丽红)

Effect of Rad on Myocardial Cells Hypertrophy Induced by Cardiotrophin-1

LIUYu-feng,GENGZhao-hua,NIULi-li.DepartmentofCardiology,JiaxingFirstHospital,theFirstAffiliatedHospitalofJiaxingUniversity,Jiaxing314000,China

Objective To explore the effects of small G-protein Rad on cardiotrophin-1(CT-1)induced myocardial cells hypertrophy.Methods From June 2011 to March 2013,we selected 60 newborn healthy male SD rats.Ad-Radwith Rad genes and Ad-GFP containing gene encoding green fluorescent protein were made.Hearts were taken out from rats and were cut into pieces to conduct myocardial cell primary culture.Using random number table method,we divided the primary myocardial cells into 6 groups:blank control group〔transfection by phosphatebuffer solution(PBS) with PBS as irritant〕,Ad-GFP group(transfection by Ad-GFP with PBS as irritant),Ad-Rad group (transfection by Ad-Rad with PBS as irritant),CT-1 control group (transfection by PBS with CT-1 as irritant),Ad-GFP+CT-1 group (transfection by Ad-GFP with CT-1 as irritant) and Ad-Rad+CT-1group (transfection by Ad-Rad with CT-1as irritant).After adenovirus vector transfection for 48 hours,we detected transfection rate of adenovirus vector by flow cytometry,detected the mRNA expression levels of Rad,ANF and β-MHC by RT-PCR method and measured Rad expression by Western blotting method.Results The transfection rate of adenovirus vector was 95.51%.The expression level of Rad mRNA in Ad-Rad group was higher than that in control group,Ad-GFP group,CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group(P<0.05);the expression level of Rad mRNA in Ad-Rad+CT-1 group was higher than that in control group,Ad-GFP group,CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group (P<0.05).The expression level of ANF mRNA in CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group was higher than that in control group,Ad-GFP group and Ad-Rad group (P<0.05);the expression level of ANF mRNA in Ad-Rad+CT-1 group was lower than that in control group,Ad-GFP group,Ad-Rad group,CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group (P<0.05).The expression level of β-MHC mRNA in CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group was higher than that in control group,Ad-GFP group and Ad-Rad group (P<0.05);the expression level of β-MHC mRNA in Ad-Rad+CT-1 group was lower than that in CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group (P<0.05).The expression level of Rad in Ad-Rad group was higher than that in control group,Ad-GFP group,CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group(P<0.05);the expression level of Rad in Ad-Rad+CT-1 group was higher than that in control group,Ad-GFP group,CT-1 control group and Ad-GFP+CT-1 group (P<0.05).Conclusion Rad down-regulates the hypertrophic response of myocardial cells induced by CT-1.

Hypertrophy;Myocytes,cardiac;Rad;Cardiotrophin-1;Adenoviruses

国家自然科学基金资助项目(81070093)；重庆市科技攻关计划项目(CSTC，2011AC5031)

314000 浙江省嘉兴市第一医院 嘉兴学院附属第一医院心血管内科(刘玉峰)；第三军医大学第二附属医院心血管内科(耿召华)；北京军区总医院心血管内科(牛丽丽)

耿召华，400037重庆市，第三军医大学第二附属医院心血管内科；E-mail：gengzhh@tom.com

R 542.2 R 364.3

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.09.010

2015-05-30；

2016-01-05)