木香及藏木香挥发油对斑马鱼胚胎发育毒性研究

杨雨婷　何贝轩　彭　成，2　张　雪　卢俊宇　熊　亮，2　何育霖　曹治兴 *

1. 成都中医药大学，四川　成都　611137；

2.中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川　成都　610075



木香及藏木香挥发油对斑马鱼胚胎发育毒性研究

杨雨婷1,2何贝轩1彭成1，2张雪1,2卢俊宇1熊亮1，2何育霖1曹治兴1,2 *

1. 成都中医药大学，四川成都611137；

2.中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都610075

【摘要】目的：以斑马鱼胚胎为模型，研究木香及藏木香挥发油对斑马鱼胚胎发育毒性及心脏发育毒性的影响。方法：采用斑马鱼胚胎模型，将其暴露于含有不同浓度(50、25、12.5、6、3、1.5mg·L-1)的木香及藏木香挥发油中培养96h，于24，48，72，96hpf观察斑马鱼胚胎发育形态，畸形率，24hpf摆尾率，48hpf心率及各时间点的死亡率。结果：24hpf，藏木香挥发油和木香挥发油对斑马鱼胚胎毒性的LC50分别为12.71、44.88mg·L-1； 96hpf藏木香挥发油和木香挥发油对斑马鱼胚胎毒性的LC50分别为7.11、17.18mg·L-1。在6mg·L-196hpf藏木香挥发油胚胎发育主要表现为脊柱侧弯、心脏水肿、卵黄囊水肿；而相同浓度、相同剂量的木香挥发油则未监测到该现象。12mg·L-1藏木香挥发油可致斑马鱼摆尾次数和心率明显下降(P<0.01)，木香挥发油则无明显影响(P>0.05)。结论：藏木香和木香挥发油对斑马鱼毒性大小：藏木香挥发油>木香挥发油。

【关键词】藏木香挥发油；木香挥发油；斑马鱼；胚胎发育毒性

斑马鱼是鲤科短担尼鱼属，原产于南亚，是一种常见的热带鱼。目前的生命科学研究中，斑马鱼是三种主要模式脊椎动物之一，被世界广泛关注，是公认的新兴模式脊椎动物。斑马鱼个体小，能大规模繁殖；体外受精，胚胎发育透明，胚胎早期发育快，易于大量获取实验所需样品。因其早期发育身体透明，易于对胚胎发育过程进行直接观察，且对母体无伤害，故可用作毒性学评价模型[1]。

木香为菊科多年生草本植物木香AucklandialappaDecne.干燥根，主产于云南等地。木香主要含挥发油，其气味芳香浓烈而特异，有行气止痛之功效，被广泛用于治疗脾胃、大肠及肝胆气滞证等[2]。临床上木香被广泛应用，为湿浊中阻呕吐之要药，可单用或配伍用于治疗妊娠呕吐。藏木香是一味民间藏药，又名青木香，藏名“玛奴”，为菊科植物藏木香InularacemosaHook.f. 的干燥根，其味辛、苦，性温，具有调气解郁、健脾和胃、止痛等功效，临床上常用于治疗胎动不安、胃肠功能紊乱等症[3]。目前，木香及藏木香挥发油的安全性评价对比研究尚未见报道，故本课题采用斑马鱼模型，对木香及藏木香挥发油进行体内胚胎发育的安全性比较实验。

1实验与方法

1.1材料

1.1.1实验药物木香挥发油、藏木香挥发油(成都中医药大学药物研究所，批号20150222)，均以二甲基亚砜(DMSO)配成50mg·L-1的浓缩液备用。

1.1.2实验动物健康AB品系野生型斑马鱼，由四川大学生物治疗国家重点实验室馈赠。培育于成都中医药大学斑马鱼实验室。

1.1.3主要仪器与试剂氯化钠、碳酸氢钠、氯化钾等试剂(使用试剂均为分析纯，厂家：成都市科龙化工试剂厂 批号：144-55-8)；二甲基亚砜(DMSO，SIGMA公司，批号：SZBE0170V)，体视荧光显微镜(Leica 型号M165Flc)：斑马鱼循环水养殖系统(北京爱生科技公司)；微量移液器(德国Eppendorf公司)；光照培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，型号MGC-100)；斑马鱼胚胎繁殖培养液10% Hank′s液(13.7mmol/L NaCl，0.54mmol/L KCl，0.025mmol/L Na2HPO4，0.044mmol/L KH2PO4，1.3mmol/L CaCl2，1.0mmol/L MgSO4，0.42mmol/L NaHCO3)。

1.2方法

1.2.1胚胎收集依照斑马鱼及相关实验技术[4]中所述方式，傍晚，将正常成年斑马鱼雌∶雄=1∶1，放入产卵盒内，用隔板分离。水温控制在27.5℃～28.5℃，控制光周期为14∶10(即光照14h，黑暗10h)，至次日早晨转变为光照期配对，3h后吸去粪便等污物，用10% Hank′s液冲洗数次，选取发育正常的胚胎进行实验。

1.2.2给药方法将配置好的木香及藏木香挥发油的浓缩液加入新鲜10%Hank′s液中，按二倍梯度稀释法，稀释为6个浓度，即50、25、12、6、3、1.5mg·L-1，于10hpf将斑马鱼胚胎暴露于药液中，按20个/孔置于24孔板，每孔容积为1.5ml，以DMSO为溶剂对照，并设置空白对照，置于培养箱中孵化96h。

1.2.3观察指标从10hpf起连续培养在对应浓度的对照组和药液中，分别在24hpf、48hpf、72hpf、96hpf于显微镜下观察记录胚胎发育情况，统计药物作用于斑马鱼胚胎发育过程中的死亡率、畸形率、成活率和心率等指标，并以死亡率计算不同时间点的LC50。

1.3统计学方法采用SPSS17.0统计分析软件中的方差分析法检验各实验组及对照组之间的差异，并采用两两配对多重比较的方法分析各组之间差异的统计学意义，检验水准a=0.05。

3结果

3.1木香及藏木香挥发油对斑马鱼胚胎死亡率的影响以胚胎死亡为终点观察指标，给予木香及藏木香挥发油不同浓度和不同暴露时间，结果，在48hpf内，随着暴露时间的延长，两组斑马鱼胚胎死亡率均逐渐增加。其中，作用24h时，木香挥发油、藏木香挥发油对斑马鱼胚胎毒性的LC50及95%置信区间分别为 44.88(34.36～72.11)、12.71(9.42～17.23)mg·L-1；作用48h时LC50的95%置信区间分别为17.18(14.52～21.56)、7.11(5.50～9.07)mg·L-1。具体实验结果见表1。结果表明，两个药物均对斑马鱼有胚胎发育毒性，其毒性为木香挥发油>藏木香挥发油。

表1　木香及藏木香挥发油对斑马鱼胚胎发育的LC50(24hpf、48hpf、96hpf)

3.2.2木香及藏木香挥发油对斑马鱼胚胎存活率的影响斑马鱼胚胎暴露于含有木香或藏木香挥发油12mg·L-1的10% Hank′s液，10hpf～48hpf随着药物暴露时间的延长，斑马鱼胚胎的毒性逐渐增强，而在48～96hpf时间段内，未见毒性蓄积效应。从表2可见，在相同作用时间和作用浓度下，毒性从小到大依次为木香挥发油>藏木香挥发油。

表2木香及藏木香挥发油对斑马鱼胚胎成活率的影响

注：与木香挥发油组比较，**P<0.01

3.2.3木香及藏木香挥发油对斑马鱼胚胎发育形态学的影响分别于24hpf、96hpf在显微镜下观察斑马鱼的形态发育，拍摄木香及藏木香挥发油组在12mg·L-1和6mg·L-1的胚胎发育情况(见图1)。24hpf空白对照组已出膜为幼鱼，正常发育； 24hpf 12mg·L-1和6mg·L-1木香挥法油组出现不同程度的脊柱侧弯；对应浓度的藏木香挥发油组表现出心脏和卵黄囊肿大、脊柱侧弯； 96hpf 空白对照组； 96hpf 木香挥发油组仅 12mg·L-1脊柱稍微侧弯，藏木香挥法油组表现出不同程度的心脏卵黄囊肿大、脊柱侧弯。

注：A. 24hpf空白对照组；B. 24hpf 12mg·L-1木香挥法油组：脊柱严重侧弯；C. 24hpf 6mg·L-1木香挥法油组：脊柱弯曲；D. 24hpf 12mg·L-1藏木香挥法油组；E.24hpf 6mg·L-1藏木香挥法油组：心脏肿大；F. 96hpf 空白对照组；G. 96hpf 12mg/L木香挥法油；H.96hpf 6mg/L木香挥法油：正常发育；I. 96hpf 12mg/L藏木香挥法油；J. 96hpf 6mg/L藏木香挥法油。

3.2.4木香及藏木香挥发油对斑马鱼摆尾次数的影响斑马鱼胚胎发育至24h，其尾部会表现出强烈的抽动，当将其暴露于上述药物时，由于发育异常而影响此摆尾活动。于24hpf，12mg·L-1浓度下记录1min内斑马鱼幼鱼的摆尾次数。结果显示，，正常对照组胚胎摆尾次数为4.50次·min-1，藏木香挥发油组1.13次·min-1，有差异具有统计学意义(P<0.01)，木香挥发油3.91次·min-1,与空白对照比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结果详见表2。

表3　木香及藏木香挥发油作用24h对

3.2.5木香及藏木香挥发油对斑马鱼胚胎发育的畸形率与空白对照组比较，木香及藏木香挥发油在12 mg·L-1时，48hpf，藏木香挥发油的畸形率高于木香挥发油组，结果差异具有统计学意义(P<0.05)，但在48h后，木香及藏木香挥发油的畸形率不变。结果见表4。

表4　木香及藏木香挥发油致斑马鱼胚胎畸形发育

注：与木香挥发油组比较，**P<0.01。

3.2.6木香及藏木香挥发油对斑马鱼心率的影响48hpf，在显微镜下记录30s内斑马鱼心跳次数。选取最低毒性剂量12mg·L-1记录各组斑马鱼心率次数，比较藏木香挥法油和木香挥法油对斑马鱼心脏发育的影响。结果显示，与空白对照组比较，藏木香挥发油组和木香挥发油的斑马鱼心率明显减慢。结果见表5。

±s)

注：与空白对照组比较，**P<0.01。

4讨论

《日华子本草》记载木香有“治心腹一切气，止泻，霍乱，痢疾，安胎，健脾消食。疗羸劣，膀胱冷痛，呕逆反胃”之效；《西藏常用中草药》记载藏木香有“健脾和胃、调气解郁、止痛、安胎。治慢性胃炎、胃肠机能紊乱、肋间神经痛、胸壁挫伤和岔气作痛”的功效，近期研究表明，木香及藏木香均有不同程度的抗肿瘤作用，可作为临床潜在的抗癌开发药物[5-6]。 但对于藏木香和木香的基础毒性研究报道甚少[7]，且传统的动物毒性无法实时直观地观测到药物对于胚胎发育的影响，也无法快速大量地统计药物对于胚胎发育致畸的影响。故本实验利用斑马鱼胚胎发育透明、对药物作用敏感且能直接观测到药物对于斑马鱼胚胎发育作用的特性，探讨木香及藏木香挥发油对斑马鱼胚胎发育的影响。实验结果表明，24hpf摆尾次数，48hpf的心率、各时间点的存活率、畸形率及斑马鱼形态发育指标可看出，木香挥发油较藏木香挥发油对斑马鱼胚胎发育毒性小，木香挥发油对斑马鱼胚胎的LC50亦明显高于藏木香挥发油。由此可见，木香挥发油对斑马鱼胚胎发育毒性较藏木香挥发油安全。提示临床用药时，有必要重视藏木香对胚胎发育的影响，建议孕妇和哺乳期的妇女慎用该药物，也不应长期或大量给予婴幼儿使用含有藏木香挥法油的药物；木香虽较藏木香安全，但在所设定的剂量范围内，木香挥发油仍有致畸作用，故建议进一步采用多种模型确立其安全范围，为临床合理用药提供依据。

参考文献

[1]Westerfield M. The Zebrafish Book[M].Eugene:University of Oregon Press,1993.

[2]国家药典委员会.中国药典.一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010:57-58.

[3]Lokhande.PD,Dhaware.BS,Jagdale.SC, et al.Cardiac activity of isolated consitituents ofInularacemosa[J].Journal of Herbal Pharmacotherapy.2006,6(3-4):81-88.

[4]董武.斑马鱼及相关实验技术[M].青岛：中国海洋大学出版社，2006,6-8.

[5] Pandey Madan Mohan,Rastogi Subha,Rawat Ajay Kumar Singh.Saussurea costus:botanical,chemical and pharmacological review of an ayurvedic medicinal plant[J].J Ethnopharmacol,2007,110(3):379-390.

[6] Pal HC,Sehar I,Bhushan S,et al.Activation of caspases and poly(ADP-ribose)polymerase cleavage to induce apoptosis in leukemia HL-60 cells by Inula racemosa[J].Toxicology in Vitro,2010,6(24):1599-1609.

[7] 李茹柳，黄习文，李卫民，等.厚朴丸方中单味药木香药效学和急性毒性研究[J].中药药理与临床，2009,25(2)：82-84.

Toxicity of the oil ofAucklandialappaDecne. and the oil ofInularacemosaHook.f. to zebrafish embryos

YANG Yuting1,2HE Beixuan1PENG Cheng1,2ZHANG Xue1,2LU Junyu1XIONG Liang1,2HE Yulin1CAO Zhixing1,2*

1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137，China

2.State Key Laboratory of Systematic Research and Exploitation of TCM, Chengdu 610075，China

Abstract:Objective The difference toxicity between the oil of Aucklandia lappa Decne.and the oil of Inula racemosa Hook.f. to the developing zebrafish embryos.Methods LC50,survival rate, spontaneous movement of embryos, heart beat rate and morphologic change were detected in 10h zebrafish embryos with incubation of the oil of Aucklandia lappa Decne.and the oil of Inula racemosa Hook.f. for 96h.Results The LC50values of the oil of Aucklandia lappa Decne.and the oil of Inula racemosa Hook.f. were 12.71 mg·L-1and 44.88mg·L-1at 24hpf respectively; The LC50values of the oil of Aucklandia lappa Decne. and the oil of Inula racemosa Hook.f. were 7.11 mg·L-1、17.18mg·L-1at 96hpf,respectively. 6 mg·L-196hpf zebrafish larvae with the characteristic of was scoliosis,cardiac edema and yolk edema for the oil of Inula racemosa Hook.f..But these phenomena did not occur to the oil of Aucklandia lappa Decne. in the same condision. The oil of Inula racemosa Hook.f. caused the reduction of spontaneous movement and heart rate(P<0.01)，the oil of Aucklandia lappa Decne.had no effect on it.(P>0.05)Conclusion Compared with the oil of Aucklandia lappa Decne., the oil of Inula racemosa Hook.f. had lower toxicity to zebrafish embryos

Key words:zebrafish embryos; toxicity; the oil of Aucklandia lappa Decne.; the oil of Inula racemosa Hook.f.

(收稿日期：2015.09.28)

【中图分类号】R285.5

【文献标志码】A

【文章编号】1007-8517(2016)01-0023-03

作者简介：杨雨婷，研究生在读，主要从事中药药理与毒理学研究，E-mail：349802920@qq.com通信作者：曹治兴，博士，讲师，主要从事肿瘤分子生物药效学和毒理学，E-mail：284886361@qq.com

基金项目：国家科技支撑计划(2011BAI13B05)。