海分枝杆菌感染斑马鱼成鱼模型的构建

杨国威，彭世泽，张永欣，赵建元，岑山

由结核分枝杆菌感染导致的结核病是一种重大感染性疾病，严重威胁着我国和世界的公共卫生健康[1-3]。虽然异烟肼等抗结核药物可以有效控制药物敏感菌感染引起的结核病，但是由于近年来各种耐药结核菌的不断出现，导致药物治疗失败，结核病发病率逐年上升。因此，亟需发展新型抗结核药物以有效控制结核病的广泛传播[4-7]。

由于结核分枝杆菌生长缓慢、生物安全等级高，所以结核病动物模型一直是抗结核药物研发的瓶颈问题。由于伦理以及成本等原因，使得灵长类动物难以作为广泛应用的结核病药物筛选及理论研究动物模型[8]。啮齿类动物模型无法完全模拟人感染结核分枝杆菌中的多种病理变化[7,9]，具有相当的局限性。因此，构建理想的体内动物模型对于抗结核药物的研发尤为关键。

近年来，只具有天然免疫系统的海分枝杆菌-斑马鱼幼鱼模型已经被广泛应用于结核病致病机制以及药物筛选方面的研究，例如结核病肉芽肿的形成与成熟机制等基础研究[10-13]以及依赖荧光的细菌菌数计数法用于药物筛选等[14-15]。不同于斑马鱼幼鱼，斑马鱼成鱼同时具有先天免疫系统以及后天免疫系统。鉴于后天免疫系统在控制结核病方面具有关键的作用[16-17]，海分枝杆菌感染斑马鱼成鱼模型更为接近正常生理状态。目前，尽管海分枝杆菌感染斑马鱼成鱼模型已在结核病致病机制和结核病疫苗等方面的研究中广泛应用[18-19]，但在抗结核药物评价与筛选中的应用鲜有报道。在本研究中，我们建立了海分枝杆菌-斑马鱼成鱼感染模型，并结合 qPCR 菌数计数法，探索其在抗结核药物筛选与评价中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株Mycobacterium.marinumATCC 927 strains 接种于 7H9 液体培养基中，30 ℃、180 r/min 振荡培养至对数生长期。

1.1.2 实验动物 斑马鱼（Danio rerio）AB 系，由本院张靖溥教授惠赠。

1.1.3 试剂盒 SYBR Premix Ex Taq II Tli（NaseH Plus）试剂盒购自日本 Takara 公司。

1.2 方法

1.2.1 显微注射 斑马鱼成鱼麻醉后，用注射器将菌液由斑马鱼腹腔呈 45° 注射入鱼体内，每次注射剂量为 100 μl。

1.2.2 利福平的处理方法 海分枝杆菌 927 腹腔注射斑马鱼 24 h 后，向海水中加入适量的药物，每天给鱼换水并加药；另一组不给药，每天只更换海水。给药处理 14 d 后，用 HE 以及 Ziehl-Neelsen 染色的方式，观察斑马鱼体内肉芽肿形成情况，并对形成的肉芽肿数采用 qPCR 的方法进行计数。利福平药物剂量的选择是通过预实验的结果最终确定为 200 和 400 μmol/L 两个剂量。

1.2.3 斑马鱼切片染色 斑马鱼用福尔马林液固定过夜后，依次脱水、透明、包埋和切片。石蜡切片脱蜡后，进行 HE 染色和 Ziehl-Neelsen 染色。

1.2.4 qPCR 测定海分枝杆菌 DNA 将待处理的斑马鱼放入 -20 ℃ 冻存一段时间后，解剖取其内脏，将样品匀浆后，用 Qiagen 试剂盒提取样品中的基因组 DNA。扩增 16S～23S，ITS 引物为 F：5' CACCACGAGAAACACTCCAA 3'；R：5' ACA TCCCGAAACCAACAGAG 3'。反应体系为 Mix 12.5 μl、10 mmol/L 引物各 1 μl，DNA 3 μl，用 ddH2O 补至 20 μl。循环条件为 95 ℃ 10 s，65 ℃ 34 s，40 个循环，使用实时荧光定量 PCR 仪进行扩增。每个样品设置 3 个重复，统计各个样品的 CT 值。根据标准曲线计算斑马鱼体内的细菌数。1.2.5 IC50的计算 根据对照组和实验组斑马鱼 体内的细菌数，算出各浓度组对应的抑制率，然后用 Prism 5.01 计算每个药物的 IC50。

2 结果

2.1 海分枝杆菌感染斑马鱼成鱼

首先取 16 只成鱼斑马鱼，随机分为两组，然后分别用 5300 CFU 的海分枝杆菌或 PBS 进行腹腔注射感染，观察其成活率一直到第 5 周（图1）。

图1 海分枝杆菌 927 感染斑马鱼成鱼成活率曲线 Figure 1 Survival ratio of the adult zebrafish were injected with M.marinum strains 927 or PBS

图2 海分枝杆菌 927 可以导致斑马鱼体内产生肉芽肿（A：斑马鱼卵巢切片 HE 和 Ziehl-Neelsen 染色；B：斑马鱼胰腺切片 HE 和 Ziehl-Neelsen 染色；放大倍数 200 ×） Figure 2 Granuloma formation of adult zebrafish infected with M.marinum 927 (A：Ziehl-Neelsen staining and HE staining of ovary; B：Ziehl-Neelsen staining and HE staining of pancreas; Magnification of 200 ×)

在此注射剂量下，斑马鱼于第 3 周开始死亡。5 周后，死亡率可以达到 20% 左右。第 5 周对斑马鱼进行切片，分别用 Ziehl-Neelsen 以及 HE 染色，观察斑马鱼体内肉芽肿的形成，以及海分枝杆菌的分布情况。HE 染色显示，斑马鱼卵巢、肠系膜、胰腺处形成数目众多的肉芽肿；Ziehl-Neelsen 染色显示肉芽肿处存在海分枝杆菌（图2）。上述结果说明海分枝杆菌 927 可以感染斑马鱼成鱼形成肉芽肿，并且会导致斑马鱼的死亡。

2.2 利福平可以减少海分枝杆菌感染斑马鱼体内的肉芽肿数目和细菌数

图3 利福平对斑马鱼成鱼结核病的治疗作用（A：对照组斑马鱼卵巢切片 HE 和 Ziehl-Neelsen 染色；B：利福平 400 μmol/L 给药组斑马鱼卵巢切片 HE 和 Ziehl-Neelsen 染色；C：各处理组斑马鱼体内肉芽肿数；D：各处理组斑马鱼体内细菌数；放大倍数 200 ×；*P ＜ 0.05） Figure 3 Rifampicin can rescue the infected zebrafish (A：Ziehl-Neelsen staining and HE staining of the control group; B：Ziehl-Neelsen staining and HE staining of 400 μmol/L rifampicin group; C：Granulomas of each group; D：CFU of each group; Magnification of 200 ×; *P ＜ 0.05)

选用利福平对感染了海分枝杆菌的斑马鱼成鱼进行治疗，验证其作为抗结核药物评价体系的 可行性。取 30 只斑马鱼成鱼，用 5 × 103CFU 的海分枝杆菌 927 进行注射感染，然后随机分为 3 组，分别用利福平 200 和 400 μmol/L 处理，另一组作为对照。治疗两个星期后，用 HE 以及 Ziehl-Neelsen 染色的方式，观察斑马鱼体内肉芽肿形成情况，并对形成的肉芽肿数进行计数。结果如图3所示，对照组在卵巢处最容易形成数目众多 的未成熟的肉芽肿，而 400 μmol/L 给药组没有肉芽肿（图3A 和 3B）。计数结果显示，对照组肉 芽肿数目平均达到 28 个，200 μmol/L 给药组有 5.6 个，而高剂量组未发现肉芽肿，三者具有显著性差异（图3C）。结果表明，抗结核药物可以有效抑制海分枝杆菌 927 感染斑马鱼所形成的肉芽肿。同时，利用 qPCR 测定细菌数目的方法，测 定了各组斑马鱼体内的海分枝杆菌数量。研究表明，对照组海分枝杆菌的数目明显上升，达到 9 × 105CFU，200 μmol/L 给药组海分枝杆菌达到 4 × 104CFU，而 400 μmol/L 给药组斑马鱼体内的细菌数没有增长，表明斑马鱼体内的细菌数与肉芽肿数目有明显的相关性，也说明抗结核药物利福平可以对斑马鱼成鱼结核病进行治疗，斑马鱼成鱼感染模型可以用于抗结核药物的筛选。

2.3 应用 qPCR 计算利福平成鱼给药的 IC50

用 qPCR 计数法计算斑马鱼体内的细菌数，并计算利福平的 IC50。结果如图4所示，利福平的 IC50为 52.5 μmol/L，与前期在斑马鱼幼鱼身上算出的 IC50（42.5 μmol/L）基本相似，表明了利福平对幼鱼以及成鱼的治疗效果相似，也说明应用海分枝杆菌感染斑马鱼成鱼模型进行药物筛选的可靠性。

图4 利福平浓度抑制率曲线 Figure 4 Rifampicin concentration-inhibitory rate curve

3 讨论

结核分枝杆菌感染的一个重要特征就是形成肉芽肿，它是由被感染的巨噬细胞、粒细胞、淋 巴细胞等免疫细胞相互作用形成的干酪样坏死结构[7]。海分枝杆菌感染斑马鱼，并表现为感染早期细菌数目的急剧增多以及干酪样肉芽肿的形成，与结核杆菌感染哺乳动物的病程和病理表现非常相似[6]。据文献报道，应用不同浓度的海分枝杆菌 927 注射斑马鱼成鱼会对斑马鱼的存活率造成不同的影响[18]。在本研究里我们应用（5300 ± 1066）CFU 海分枝杆菌 927 剂量下注射斑马鱼成鱼，到第 5 周，斑马鱼的死亡率可以达到 20% 左右，并且经 HE 染色显示，斑马鱼卵巢、肠系膜、胰腺处形成数目众多的肉芽肿，并经 Ziehl-Neelsen 染色证明了海分枝杆菌在肉芽肿处的存在。而对照组在卵巢处最容易形成数目众多的未成熟的肉芽肿，因此，在利福平用于治疗感染了海分枝杆菌的斑马鱼时，我们重点开展了对卵巢肉芽肿的分布和数量的分析。

本研究中，我们在海分枝杆菌感染斑马鱼成鱼模型上建立了基于 qPCR 计数法的抗结核药物药效评价系统。通过 qPCR 计数法，可以准确地对斑马鱼成鱼体内的细菌数目进行计数，进而对药物的给药效果进行评价。同时结合 Ziehl-Neelsen染色以及 HE 染色，可以检测斑马鱼体内的肉芽肿的 数目和形态，因而可以系统地、深入地对药物的 给药效果进行分析。同时，应用海分枝杆菌感染斑马鱼模型可以在免疫系统正常的体内生理环境下初步评价先导化合物的有效性及其体内毒性，进而快速判断化合物的成药性，有效地降低药物筛选的成本。