沙棘叶总黄酮的提取工艺优化

李淑珍　武　飞　陈月林　杨　颖

1.乌兰察布医学高等专科学校，内蒙古　乌兰察布　012000；

2.内蒙古自治区乌兰察布中心医院，内蒙古　乌兰察布　012000



沙棘叶总黄酮的提取工艺优化

李淑珍1武飞2*陈月林1杨颖1

1.乌兰察布医学高等专科学校，内蒙古乌兰察布012000；

2.内蒙古自治区乌兰察布中心医院，内蒙古乌兰察布012000

【摘要】目的：对沙棘叶总黄酮的提取工艺进行优化。方法：采用溶剂浸提法提取沙棘叶总黄酮，利用分光光度法测定总黄酮的含量，正交试验进行优化。结果：取7月份沙棘叶粉碎物，过35目筛，经正交实验优化后的提供工艺为：用60%的乙醇作溶剂，固液比为1∶20，在80℃提取30min，用此方法100g叶粉碎物经提取可得8.71g粗制品，总黄酮提取率达0.14%。结论：上述工艺操作简单、方法可靠，产品得率高，提取性能较好，适合于沙棘总黄酮大规模提取。

【关键词】沙棘叶；总黄酮；提取工艺；正交试验

沙棘(HippopherhamnoidsL.)属胡颓子科沙棘属植物，又名醋柳，被国际医药学家和营养学家誉为人类21世纪最具发展前途的医药及营养保健植物。其根、茎、叶、果实等都含有维生素、黄酮类化合物和丰富的矿物质元素等，为药食同源植物，并广泛应用于食品、医药、化妆品等多个领域[1]。沙棘1977年收载于《中华人民共和国药典》，所含的黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、降血糖、保护心血管等多种生物活性[2-3]。内蒙古沙棘资源具有分布广、种植面积大、果实质量高等特点，对沙棘产业的发展十分有利。且沙棘作为防护林发挥着巨大作用，种植面积也逐年增加。而沙棘果实黄酮的开发已经报道很多[4-5]，从叶中提取黄酮类化合物也具有原料来源广泛、成本低廉的优势[6]。研究从沙棘叶提取黄酮，旨在筛选适合沙棘叶黄酮的提取工艺，获取高含量的总黄酮，促进沙棘资源的综合利用。

1仪器与试剂

1.1仪器722可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；DZKW-S-8电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂)；RE-52旋转真空蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；101-2型数显电热鼓风恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)。

1.2材料沙棘叶采于内蒙古乌兰察布市(集宁区)卓资县郊野，经杨鸿飞教授鉴定沙棘(HippopherhamnoidsL.)的叶。并将其充分粉碎，过35目筛，置于干燥器中备用。芦丁对照品(批号：100080-201407，中国药品生物制品检定所)。其他试剂均为分析纯。

2方法及结果

2.1沙棘叶总黄酮含量的测定

2.1.1标准曲线的制作准确称取在120℃干燥至恒重的芦丁标准品20mg，用70%的乙醇溶解并定容至100ml，使其浓度为200μg/ml。分别取10、15、20、25、30、35、40、45ml，用70%的乙醇定容50ml，即为40、60、80、100、120、140、160、180μg/ml的芦丁溶液。各取1ml于试管中，加70%的乙醇1ml，加入0.5ml 5%的NaNO2，混匀后放置6min；然后加入0.5ml 10%的Al(NO3)3溶液，摇匀后放置6min；最后再加入6ml 4%NaOH，放置15min，在510nm处测定不同浓度标准品的吸光值(亚硝酸钠-硝酸铝比色法)。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标绘制芦丁标准曲线。得回归方程：Y=477.38X-2.261(R=0.9979)，结果表明芦丁在0～120μg/ml浓度范围内呈良好线性关系。

2.1.2样品中黄酮含量的测定取一定量的沙棘叶黄酮样品，配制成样液。再取一定量总黄酮样液，定容至某一体积。各取1ml于试管中，采用“2.1.1”项比色法测定吸光值，计算总黄酮含量。

X=Y×V×n×100%/m。

式中，X为样品中总黄酮含量，Y为样液中总黄酮浓度(mg/mL)，由回归方程可算得；V为样液体积(mL)；n为稀释倍数；m为样品量(mg)[7]。

2.2提取条件的优化

2.2.1提取溶剂的选择取8份过35目筛的6月份沙棘叶粉碎物各1g，分别加入甲醇、乙醇、水、氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇10ml，在70℃水浴加热提取10min，过滤。用70%乙醇统一定容到50ml，各取1ml于试管中，采用2.1.1项比色法测定吸光值，计算提取率。同样方法做3次平行试验，确定提取的最佳溶剂，结果见图1。

由图1可知，沙棘总黄酮在甲醇、乙醇、水等极性溶剂中溶解度大，提取率高；在氯仿、正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、丙酮等溶剂中溶解度小，提取率低。在所测溶剂中，甲醇最好，但甲醇有毒，给操作带来不便。由于乙醇具有、无异味、无残留、安全性好等优点，且容易回收，故选用乙醇为提取溶剂。

2.2.2提取原材料的选择取5份过35目筛的5～9月份沙棘的叶粉碎样品各10g，加入50%乙醇150ml，在70℃水浴加热提取30min，过滤，蒸发乙醇，用50%乙醇定容到100ml，稀释取5ml定容到50ml的容量瓶中，取1ml于试管中，测定吸光值，计算总黄酮含量，选择最佳提取原材料。

黄酮化合物是植物生理过程中的次生代谢产物，这些物质的往往受到植物发育阶段酶的调节和遗传机制的控制。不同发育阶段黄酮化合物含量不同。由图2可知，5月份日照时间长，植物正处在生长的旺盛阶段，故5月份黄酮含量高；随后植物生长变缓，合成量减少或转化为其他物质，故含量下降。但西北地区5月份叶子处于发芽阶段，产量低，不宜选用。7月叶子已经长成，也未结果，又出现了黄酮含量的高峰，不宜用7月份叶作为实验原材料。

2.2.3多因素正交试验在单因素筛选的基础上，设计多因素试验表，见表1。取7月份叶粉碎样品1g，按照下列正交试验条件进行提取、过滤，用70%乙醇统一定容至30ml。各取1ml于试管中，测定吸光值，计算总黄酮含量，确定优化后的提取条件。

表1　沙棘总黄酮提取条件的正交试验结果

表2　沙棘总黄酮提取条件正交试验结果的方差分析

F0.05(3，3)=9.277F0.01(3，3)=29.46

多因素正交试验结果见表1，直观分析得出：叶中提取总黄酮的影响因素的顺序是：C>B>A>D，即提取温度>固液比>乙醇浓度>提取时间，优化组合后的提取因素的选择为A2B2C3D1。方差分析的结果见表2，影响提取沙棘总黄酮各因素均为极显著因子(P<0.01)。综合考虑最佳的提取条件为A2B2C3D1，即取7月份叶，用60%的乙醇作溶剂，固液比为1∶20，在80℃提取30min，提取效果较好。

2.3沙棘总黄酮的得率和含量测定准确称量沙棘7月份叶粉碎物100g，按上述确定的优化提取条件进行浸提，将浸提液在60℃减压浓缩回收乙醇，将浓缩液在60℃的干燥箱干燥，称量干燥粗制品的质量，得到粗黄酮产品得率。从中取1g用70%的乙醇溶液溶解，稀释一定倍数，取1ml测定粗制品总黄酮含量，结果见表3。

表3　沙棘总黄酮粗制品总黄酮含量测定结果

由表4可知，100g叶粉碎样品经此提取条件提取，可得到8.71g粗黄酮产品，叶粗制品黄酮含量达0.14%，并且RSD为0.68%，纯化后总黄酮含量达到14.89%，表明该工艺重复性强，稳定可靠，精密度高。

3讨论

内蒙古沙棘资源具有分布广、种植面积大、果实质量高等特点，对沙棘产业的发展十分有利[8]。且沙棘作为防护林发挥着巨大作用，种植面积也逐年增加。有研究发现沙棘所含总黄酮为叶子(876mg/100g)>果渣(502mg/100g)>鲜果汁(365mg/100g)>鲜浆果(354mg/100g)，说明从叶中提取黄酮具有重要意义[9]。对于从沙棘中提取总黄酮的方法，目前有超临界CO2流体提取、微波法提取、超声波法提取、有机溶剂提取、水浸提取等。超临界CO2萃取适用于非极性化合物的分离；微波法和超声波法提取仅限于少量提取实验，工业化大生产不宜应用。水浸提取沙棘总黄酮提取率偏低；有机溶剂提取中甲醇和丙酮含有毒成分，因此用乙醇提取沙棘黄酮是适合工业化生产的适宜方法[10]。该方法经实验优化，60%乙醇作为提取溶剂，提取30min，既节约时间，且乙醇还可以重复利用，无毒害无残留，适合工业化扩大生产。经优化工艺提取后所得叶黄酮得率为8.71%，相对较高，但黄酮含量(0.14%)较吕敏[11]采用正交试验法优选提取山西沙棘HippopherhamnoidsL.叶总黄酮含量(4.82%)较低，这可能与不同品种的沙棘黄酮含量不同有关。王亚辉等[12]对内蒙古不同产区同一品种沙棘黄酮含量研究发现：内蒙古和林格尔县(2.5±0.07)%>内蒙古凉城县(2.3±0.02)%>内蒙古东胜区(2.2±0.08)%>内蒙古翁牛特旗(1.8±0.01)%>内蒙古敖汉旗(1.7±0.09)%>内蒙古集宁区(1.4±0.01)%。除集宁外，5个产区的总黄酮含量均达到《中国药典》标准(1.5%)。实验选用沙棘品种恰好来自集宁区卓资山县，提取原材料并非5月份含量最高季节采收，而是产量较高的7月份采收，原料只提取1次，而吕敏实验提取三次，所以该实验黄酮含量相对较低。与其他研究结果比较[13-15]，产品得率较高，并且该提取工艺操作简单、乙醇无残留可重复利用，适合于沙棘总黄酮的提取，可进行规模化生产。

参考文献

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Optimize total flavonoids extraction process from leaves of Hippophae rhamnoides L．

LI Shuzhen1WU Fei2*CHEN Yuelin1YANG Ying1

1.Wulanchabu medical college, Inner Mongolia , wulanchabu 012000,China;

2. Wulanchabu central hospital,Inner Mongolia,wulanchabu 012000,China

Abstract:Objective The optimize total flavonoids extraction technology of Hippophae rhamnoides L．leaves. Methods Solvent-extraction process was used for flavonoids extraction,spectrophotometry was used to analyze the contents and the orthogonal experiment was used to optimize extraction process．Results The extraction materials were leaves of Hippophae rhamnoides L. in July,which was crushed 35 mesh. The optimum extracted conditions were 80℃, 1∶20(W/V),extracting 30 min for each time, the flavonoids content of product reached to 0.14 % , product yield was 8.71%.Conclusion The total flavones from leaves of Hippophae rhamnoides L. can be extracted by above-mentioned method, this process was simple, reliable and can get high purity product and ethanol can be reused repeatedly,the process suitable for mass production the total flavones.

Key words:Leaves of Hippophae rhamnoides L.; Total flavonoids; Extraction process; The orthogonal experiment

(收稿日期：2015.09.23)

【中图分类号】R284.2

【文献标志码】A

【文章编号】1007-8517(2016)01-0014-03

作者简介：李淑珍(1974-)，女，蒙古族，硕士研究生，副教授，主要从事天然产物的研究与开发。E-mail：448609108@qq.com通信作者：武飞(1976-)，男，蒙古族，硕士研究生，副主任医师，主要从事新药研发。E-mail：wufeiyisheng0812@126.com

基金项目：内蒙古自治区教育厅高等学校科学技术研究项目(NJZC14407)。