乳腺癌组织中VEGF-D、MMP-2及MMP-9的表达及其临床意义

张阿娜

作者单位:117000 辽宁省本溪市中心医院



乳腺癌组织中VEGF-D、MMP-2及MMP-9的表达及其临床意义

张阿娜

作者单位:117000 辽宁省本溪市中心医院

【摘要】目的探讨乳腺癌组织中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和血管内皮生长因子D(VEGF-D)表达的临床意义。方法采用免疫组化法，对60例乳腺癌组织及60例正常组织中MMP-2、MMP-9及VEGF-D表达情况进行检测。结果60例乳腺癌组织中，MMP-2、MMP-9阳性表达率分别为61.67%、56.67%，VEGF-D阳性表达率为61.67%。MMP-2、MMP-9及VEGF-D阳性表达率Ⅲ~Ⅳ期者显著高于Ⅰ~Ⅱ期者；低分化者显著高于高、中分化者；有淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者；且MMP-2与VEGF-D表达，MMP-9与VEGF-D表达均呈正相关性。结论低分化、Ⅲ~Ⅳ期乳腺癌患者高表达MMP-2、MMP-9与VEGF-D，MMPs与VEGF-D表达呈正相关性，可通过阻断VEGF-D及MMPs活性控制、治疗乳腺癌。

【关键词】乳腺癌；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9；血管内皮生长因子D

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:198～201)

乳腺癌是严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤，发病率约为每年46/10万~52/10万，近年来其发病率呈现逐年上升趋势，有效控制乳腺癌肿瘤的侵袭和转移，可以改善乳腺癌患者的预后[1]。血管内皮生长因子(VEGF)可以促进血管内皮细胞的分裂及增生能力，增加血管的通透性，促进子宫内膜细胞外的信息分子雌激素，并激活激素受体，调控基因表达[2-3]。基质金属蛋白酶(MMPs)家族是一类结构相似的蛋白酶，能降解细胞外基质，此降解其增强肿瘤细胞浸润中突破屏障的能力有关[4-5]。本研究通过对乳腺癌患者组织中VEGF-D、MMP-2、MMP-9 的表达检测，及三者与乳腺癌侵袭、转移相关性的分析，探讨 VEGF-D、MMP-2、MMP-9 在肿瘤发展中的关系，其对于指导乳腺癌临床治疗及预后评估有重要意义。

1材料与方法

1.1　研究对象

乳腺癌组为2013年10月-2014年10月我院收治的60例乳腺癌患者外科手术切除标本，所有患者均经病理学检查确诊，纳入标准：所有患者均未进行手术、化疗、放疗治疗。对照组取自我院乳腺手术正常组织标本。所有标本均经常规石蜡包埋，5 μm厚连续切片。

1.2　试剂及仪器

羊抗人MMP-2一抗，兔抗羊MMP-2二抗；羊抗人MMP-9一抗，羊抗人VEGF-D一抗，兔抗羊VEGF-D二抗及兔抗羊 MMP-9二抗；DAB显色试剂盒与HIGH-SABC免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。其他相关试剂包括无水乙醇、二甲苯及3%H2O2等。文中主要涉及的仪器为倒置显微镜及显微镜照相系统，病理组织包埋机，免疫组化专用湿盒，免疫组化专用抗原修复架及修复盒。

1.3　方法

1.3.1免疫组化方法MMP-2和MMP-9采用HIGH-SABC免疫组化法染色，使用DAB显色及苏木精进行复染细胞核。采用石蜡切片常规脱蜡至水后，室温下浸于含3%H2O2的甲醇溶液中30 min，以灭活内源性H2O2酶活性，灭活后使用蒸馏水及PBS冲洗。将切片放入PH为8.00的0.5 mol/L EDAT缓冲液中，保持温度在95 ℃维持10 min。之后取出容器，室温下自然冷却至少15～20 min。正常兔血清室温封闭切片10～20 min，甩去多余液体，不进行冲洗。在切片中滴加羊抗人VEGF抗体，置于湿盒中，于4 ℃下孵育过夜，之后使用PBS缓冲液洗涤3次。滴加生物素化兔抗羊二抗，在37 ℃下孵育20 min，使用PBS缓冲液洗涤3次。滴加HIGH-SABC后于37 ℃下放置20 min，使用PBS缓冲液洗涤4次。使用显微镜控制显色反应时间，时长大约为5 min，之后使用蒸馏水冲洗，来终止显色。使用苏木精进行细胞核复染，复染后用自来水冲洗。脱水、透明、中性树胶封固。在显微镜下进行观察、拍照。VEGF-D免疫组化染色同上。

1.3.2结果判定MMP-2、MMP-9、VEGF判定标准相同。采用半定量积分方法[6]，并根据肿瘤细胞染色强度及阳性细胞数进行判定。随机选取×400的高倍镜5个，对阳性细胞数及肿瘤细胞总数进行计数，计数后计算阳性细胞百分率，0分：阳性细胞百分率<5%，1分：5%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：75%以上；再按多数阳性细胞呈现的染色强度进行记分：1分：淡棕黄色，2分：棕黄色，3分：棕褐色。总分为两者相乘。阴性表达：积分不超过2分，阳性表达：积分>2分。由3名临床病理医师进行阅片，根据平均值判定结果。

1.4　统计分析

应用SPSS 19.0软件对比分析本文数据，采用χ2检验进行组间比较，采用χ2检验相关性并计算列联系数，P<0.05表明差异有统计学意义。

2结果

2.1　临床特征

对照组共入组60例，年龄29～69岁，平均年龄(52.3±10.2)岁。乳腺癌组共入组60例，年龄28-65岁，平均(53.5±11.3)岁；其中13例为高分化型，32例为中分化型，15例为低分化型；按照2009年国际抗癌联盟(UICC)TNM分期标准，Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期27例。对照组与乳腺癌组年龄方面无显著性差异(P>0.05)，见表1。

表1　对照组与乳腺癌组临床特征比较/例

2.2　乳腺癌组织中MMP-2、MMP-9的表达

60例正常乳腺组织中MMP-2、MMP-9阳性表达率分别为8.33%(5/60)、6.67%(4/60)，乳腺癌组织中MMP-2、MMP-9阳性表达率分别为61.67%(37/45)、56.67%(34/45)，乳腺癌组MMP-2、MMP-9阳性表达率均显著高于正常对照组(P<0.01)；高中分化和低分化乳腺癌组织中MMP-2阳性表达率分别为53.33%(24/45)和86.67%(13/15)，MMP-9阳性表达率分别为46.67%(21/45)和86.67(13/15)，低分化患者MMP-2、MMP-9阳性表达率显著高于高中分化患者(P<0.01)；Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期患者MMP-2阳性表达率分别为48.48%(16/33)和77.78%(21/27)，MMP-9阳性表达率分别为48.48%(14/33)和66.67%(20/27)，Ⅲ～Ⅳ期患者MMP-2、MMP-9阳性表达率显著高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)；有淋巴结转移患者和无淋巴结转移患者MMP-2阳性表达率分别为75.00%(27/36)和41.67%(10/24)，MMP-9阳性表达率分别为72.22%(26/36)和33.33%(8/24)，有淋巴结转移患者MMP-2、MMP-9阳性表达率显著高于无淋巴结转移患者(P<0.05)，见表2。

表2　MMP-2、MMP-9表达与乳腺癌其临床病理特征的相关性(例，%)

2.3　乳腺癌组织中VEGF的表达

60例正常乳腺组织中无VEGF-D表达。乳腺癌组织中VEGF-D阳性表达率为61.67%(37/60)。在高中分化和低分化乳腺癌组织中VEGF-D阳性表达率分别为55.56%(25/45)和80.00%(12/15)，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期患者VEGF-D阳性表达率分别为42.42%(14/33)和85.19%(23/27)，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。有淋巴结转移组和无淋巴结转移组VEGF-D阳性表达率分别为77.78%(28/36)和37.50%(9/24)，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3　乳腺癌组织VEGF表达与其临床病理特征

2.4　乳腺癌组织中MMP-2、MMP-9与VEGF-D表达的关系

60例乳腺癌组织中30例MMP-2和VEGF同时表达，其余8例仅表达VEGF，7例仅表达MMP-2，其他15例癌组织中两者均未表达。MMP-9、VEGF-D表达呈正相关(C=0.537，P=0.0014)。

在60例乳腺癌组织中，26例MMP-9和VEGF同时表达，其余12例仅表达VEGF-D，8例仅表达MMP-9，其他 14例癌组织中两者均未表达。MMP-9和VEGF-D表达呈正相关(C=0.674，P=0.0029)。

3讨论

MMP-2主要通过特异性降解基膜的主要成分Ⅳ、Ⅴ型胶原，对肿瘤的侵袭转移有重要作用[7]。正常稳态组织中MMPs表达极少，在激素、炎性细胞因子及生长因子刺激下，其表达量上升[8]。其中MMP-9可降解多种基质成分，破坏基膜，从而导致癌细胞向人体其他部位进行浸润转移[9-10]。本研究结果表明，乳腺癌组MMP-2、MMP-9的阳性表达率均显著高于正常对照组；低分化患者MMP-2、MMP-9阳性表达率显著高于高中分化患者；Ⅲ～Ⅳ期患者MMP-2、MMP-9阳性表达率显著高于Ⅰ～Ⅱ期患者；有淋巴结转移患者MMP-2、MMP-9阳性表达率显著高于无淋巴结转移患者患者(P<0.05)。提示MMP-2、MMP-9高表达者，乳腺癌细胞的浸润性和转移性均增高。

VEGF-D是VEGF家族中的新成员，大多数人类组织中可检测到VEGF-D mRNA[11]。有研究表明，VEGF-D可结合并激活内皮细胞受体VEGFR-2，VEGFR-3的酪氨酸磷酸化[12]。体外实验均表明，VEGF-D可促进血管内皮细胞分裂、增殖，具有较强的促血管生长的作用[13]。Scoditti等[14]以腺病毒为载体，发现VEGF-D对血管生成的刺激作用超过VEGF-A，血管增生更加弥散。本研究结果提示，在60例乳腺癌组织检测中，VEGF-D阳性表达率为61.67%，而60例正常组织未见阳性表达。VEGF-D阳性表达率在Ⅲ～Ⅳ期显著高于Ⅰ～Ⅱ期；低分化显著高于高中分化者；有淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组。提示VEGF-D高表达者，乳腺癌细胞的浸润性和转移性均增高。

目前认为，MMP-2、MMP-9具有调节血管生长及微环境的作用。其与VEGF-D在肿瘤的进展中可能发挥协调作用。VEGF-D的上调表达刺激MMP-2及MMP-9的过度分泌，同时促进其mRNA的转录。本研究结果显示，高中分化、Ⅲ～Ⅳ期及淋巴结转移乳腺癌患者高表达MMP-2、MMP-9与VEGF-D，且MMP-2与VEGF-D表达呈正相关性，MMP-9与VEGF-D的表达呈正相关性，提示MMPS与VEGF-D间可能存在协同作用，并可预示通过阻断MMPS与VEGF-D的活性，可以抑制肿瘤新生血管的形成，从而达到控制、治疗肿瘤。

参考文献

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(编辑：吴小红)

The Expressions and Clinical Significance of Matrix Metalloproteinases 2(MMP-2),Matrix Metalloproteinases 9(MMP-9) and Vascular Endothelial Growth Factor-D(VEGF-D)in Breast Cancer

ZHANGA'na.TheCenterHospitalofBenxi,Benxi,117000

【Abstract】ObjectiveTo explore the expressions of matrix metalloproteinases 2(MMP-2),matrix metalloproteinases 9(MMP-9) and vascular endothelial growth factor-D(VEGF-D)and their significance in breast cancer tissues.MethodsThe expressions of MMP-2,MMP-9 and VEGF-D in 60 cases of breast cancer tissues and 60 cases of normal esophageal tissues were detected by immunohistochemistry.ResultsThe expression rates of MMP-2,MMP-9 and VEGF-D in breast cancer tissues were 61.67%,56.67% and 61.67%.The expression rates of MMP-2,MMP-9 and VEGF-D in grade Ⅲ-Ⅳ were significantly higher than that of grade Ⅰ-Ⅱ.The expression rates of MMP-2,MMP-9 and VEGF-D in patients with poor differentiation were significantly higher than that with well-mediate differentiation.The expression rates of MMP-2,MMP-9 and VEGF-D in patients with lymph node metastasis were significantly higher than that without lymph node metastasis.MMP-2 and VEGF-D expression were positively correlated.MMP-9 and VEGF-D expression were also positively correlated.ConclusionThe expression rates of MMP-2,MMP-9 and VEGF-D are closely related to poor differentiation,grade Ⅲ-Ⅳ in the breast cancer.Their expressions appear to be well-characterized indicators of tumor prognosis and metastasis.

【Key words】Breast cancer;Matrix metalloproteinases 2(MMP-2);Matrix metalloproteinases 9(MMP-9);Vascular endothelial growth factor-D(VEGF-D)

(收稿日期2015-07-31修回日期 2015-12-21)

中图分类号：R737.9

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)02-0198-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.02.007