c-Met和p-Akt与胃癌血管生成拟态的关系

苏会玲　苏红慧　陈雪霁　蔺　强　陈　坤　刘风玲

作者单位:062552 河北医科大学附属华北石油管理局总医院(苏会玲，苏红慧，陈雪霁，蔺　强，陈　坤)；050011 河北医科大学第四医院(刘风玲)

c-Met和p-Akt与胃癌血管生成拟态的关系

苏会玲苏红慧陈雪霁蔺强陈坤刘风玲

作者单位:062552 河北医科大学附属华北石油管理局总医院(苏会玲，苏红慧，陈雪霁，蔺强，陈坤)；050011 河北医科大学第四医院(刘风玲)

【摘要】目的探讨p-Akt蛋白与HGF/c-Met通路是否参与胃癌VM的形成及其可能的分子机制。方法按照入组标准与排除标准，收集胃癌患者共74例，正常对照患者16例。应用免疫组织化学法，检测肿瘤组织及正常对照组中c-Met受体、p-Akt蛋白的表达情况，应用CD-34和PAS双染法测定VM。结果c-Met受体与VM表达呈显著正相关(γ=0.277，P<0.05)，p-Akt蛋白和VM的表达呈显著正相关(γ=0.409，P<0.05)，表明c-Met受体、p-Akt蛋白与胃癌VM的生成存在显著相关性。结论胃癌组织中存在血管生成拟态。c-Met受体、p-Akt蛋白在胃癌VM发生中可能起重要作用。

【关键词】胃癌；c-Met；p-Akt；VM；血管生成；通路

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:043～046)

目前，由于胃癌缺乏明确的危险因素、特异性的早期症状等原因，胃癌常常到晚期才得以诊断。对胃癌发病机理及治疗模式的研究将有助于我们早日根治这一顽疾。

血管生成拟态是指快速增长的肿瘤细胞本身可以形成类似血管样的管道结构。血管生成拟态已在多种实体瘤中得到发现，并且存在血管生成拟态的患者预后往往不佳。

失控性的细胞生存、生长，血管生成及远处转移都是肿瘤细胞的标志性特征。最新研究表明，肝细胞生长因子(HGF)和它的受体酪氨酸激酶c-Met和这些过程密切相关，同时针对这些小分子的靶向治疗取得了初步的成效。同时c-Met受体与p-Akt蛋白的表达相关，而c-Met受体与p-Akt蛋白在VM的形成过程中是否起作用，还不是十分明确。本文探讨p-Akt蛋白与HGF/c-Met通路是否参与胃癌VM的形成及其可能的分子机制。

1材料与方法

1.1　临床资料

入组标准：术前检查资料完善、手术记录及术后病理资料完整、胃癌原发灶位于食管齿状线以下至幽门部位及术前未行新辅助放化疗，排除胃部良性肿瘤、残胃癌及既往患有其他恶性肿瘤的患者，最终本研究共收集华北石油总医院普外科2003年9月1日至2008年8月18日行手术治疗的74例患者的胃癌组织及相应的癌旁组织(距癌灶2~5 cm)。74例患者的临床病理特征见表1。年龄23~81岁，平均年龄：(58.92±11.212)岁；其中男性56例，平均年龄(60.66±10.590)岁；女性18例，平均年龄(54.72±13.024)岁。按原发灶部位，贲门+胃底部共16例，胃窦部38例，胃体部20例。按组织学分型，胃管状腺癌18例，胃低-未分化腺癌34例，胃印戒细胞癌13例，胃粘液腺癌7例，胃乳头状腺癌1例，胃肝样腺癌1例。按肿瘤分化程度，高分化5例，中分化17例，低分化及未分化52例。按照AJCC第六版TNM分期，T18例，T28例，T341例，T417例；N023例，N123例，N221例，N37例；M065例，M19例；Ⅰ期10例，Ⅱ期13例，Ⅲ期26例，Ⅳ期25例。无脉管瘤栓患者59例，存在脉管瘤栓患者15例。

1.2　实验试剂

兔抗人c-Met多克隆抗体工作液、兔抗人磷酸化蛋白激酶AKT1,2,3抗体原液(bs-5193R)、兔抗人CD34单克隆抗体工作液、兔抗人原始造血细胞、单克隆抗体工作液、二步法免疫组化检测试剂(PV-6001/PV-6002)及DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，其他试剂由华北石油总医院病理科提供。

1.3　实验方法

本研究采用免疫组织化学SP法，蜡块切成厚约4 μm放入60 ℃烘箱内烤片过夜；脱蜡；抗原微波热修复；内源性过氧化物酶灭活；滴加山羊血清封闭液；滴加兔抗人c-Met或p-Akt特异性单克隆抗体或兔抗人CD34单克隆抗体工作液，37 ℃孵育2 h；滴加山羊抗兔IgG/HRP多聚体，温育30 min；滴加DAB显色剂；苏木精复染，中性树胶封片。

CD34和PAS套染 CD34染色，DAB显色后，流水冲洗1 min终止显色反应，PAS染色按照《临床技术操作规范-病理学分册》说明进行。

1.4　阳性细胞判定标准

1.4.1c-Met和p-Akt阳性判定c-Met阳性染色为细胞胞质着色呈黄色或棕黄色颗粒。p-Akt阳性染色以胞质内着色呈黄色或棕黄色颗粒。应用Mattern积分法，即由染色阳性细胞的百分比和染色强度进行评估。每例标本选择含有阳性细胞的5个高倍镜视野(×400)，并计数100个肿瘤细胞，最后取其平均值作为阳性细胞百分率，0分：阳性细胞为0，1分：阳性细胞率≤10%，2分：阳性细胞率≤50%，3分：阳性细胞>50%；染色强度评估，0分：阴性，1分：浅黄色，2分：深黄色，3分：棕黄色。最终将上述两值相加，积分≤1视为c-Met和p-Akt阴性表达，积分≥2判定为免疫组化阳性表达。

1.4.2VM(血管生成拟态)判定标准肿瘤细胞构成VM的管壁结构，中央有红细胞存在，VM周围有PAS阳性物质，VM周围没有坏死及炎性细胞浸润，无红细胞渗漏。 以上均由病理科两名医师采用单盲法进行阅片。

1.5　随访

所有患者随访日期自手术之日起至2014年12月31日。

1.6　统计学方法

应用SPSS 13.0统计学软件进行统计分析，p-Akt、c-Met受体与各临床病理参数之间采用χ2检验；两变量相关性采用Spearman等级相关进行分析。以上均以P<0.05作为有统计学意义的标准。

2结果

2.1　胃癌患者VM

胃癌患者中存在VM，阳性率为29.73%(22/74)，而在对照组未发现VM的存在，两组间差异显著(P<0.05)。

2.2　胃癌患者VM与其临床病理参数的关系

胃癌患者VM与患者性别、年龄、原发灶部位、淋巴结转移无密切相关性(P>0.05)，而与组织学分型、肿瘤分化程度、脉管瘤栓、肿瘤浸润深度、远处转移、分期密切相关(P<0.05)，见表1。

2.3　胃癌患者c-Met受体、p-Akt蛋白表达间的相关性

c-Met受体与p-Akt蛋白表达呈显著正相关性(γ=0.501，P<0.05)，表明c-Met受体与p-Akt蛋白表达存在一定的相关性，见表2。

2.4　c-Met受体、p-Akt蛋白表达与胃癌患者VM的关系

c-Met受体、p-Akt蛋白高表达患者VM显著高于低表达患者(P<0.05)，表明c-Met受体、p-Akt蛋白与肿瘤VM显著相关，见表3。

2.5　胃癌患者c-Met受体、p-Akt蛋白与VM表达的相关性

c-Met受体与VM表达呈显著正相关(γ=0.277，P<0.05)，p-Akt蛋白与VM表达呈显著正相关(γ=0.409，P<0.05)，表明c-Met受体、p-Akt蛋白与胃癌VM的生成存在显著相关性，见表3。

表1　血管生成拟态表达与胃癌临床病理特征的关系/例

表2　胃癌c-Met受体和p-Akt蛋白表达的关系/例

表3　胃癌血管生成拟态与c-Met受体和p-Akt蛋白

3　讨论

3.1　VM的产生机制

Hess等[1]研究显示在存在VM的黑色素瘤中VE-cadherin与EphA2共同存在于细胞间接触部位，并且两者共同调节VM的生成，而EphA2的过表达又可以引起MMP2的表达上调[2]，而MMP2在肿瘤的侵润过程中起重要作用。Duxbury等[2]认为EphA2引起MMP2的表达上调是通过FAK调节的。Hess等[3]的研究又显示激活的FAK通过引起ERK1/2的磷酸化而存进MMP-2和MT1-MMP的活化。而之前的研究又显示laminin5γ2可以被MMP-2和MT1-MMP分解为5γ2'和5γ2x的片段[4]。因此该过程正如Paulis等[5]所总结的那样，乏氧诱导因子2α(HIF-2α)上调血管上皮钙黏素(VE-cadherin)的转录，VE-cadherin随后引起EphA2在细胞膜上的重新定位，定位在细胞膜上的EphA2紧接着发生磷酸化使EphA2激活。激活的EphA2受体磷酸化局部粘着斑激酶(FAK)，活化的FAK再引起细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)和磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)的激活，此外PI3K还可以不依赖FAK而被VE-cadherin/EphA2直接活化。活化的PI3K又引起前膜型基质金属蛋白酶1(pro-MT1-MMP)向活化的MT-MMP间转化，随后MT-MMP引起前基质金属蛋白酶2(pro-MMP2)的活化，活化的MT1-MMP和MMP-2共同促进层黏连蛋白5γ2(laminin5γ2)断裂成5γ2'和5γ2x片段，这些片段最终引起肿瘤组织内VM的形成。

此外，包括环磷腺苷信号通路、乏氧诱导的信号通路、环氧合酶-2信号通路在内的多种信号通路也可能参与VM的形成。

3.2　c-Met受体与p-Akt蛋白与胃癌VM生成的关系及可能的分子机制

本研究显示，胃癌患者中存在VM，阳性率为29.73%(22/74)，而在对照组未发现VM的存在，两组间差异显著(P<0.05)。并且胃癌患者VM与组织学分型、肿瘤分化程度、脉管瘤栓、肿瘤浸润深度、远处转移、分期密切相关(P<0.05)。这与刘文斌[6]、李熳[7]等的研究基本一致。刘文斌研究显示肝细胞癌中存在基质型VM，其表达与肿瘤大小、分级、分期、血管侵犯有关，是肝癌患者预后不良的独立危险因素。李熳的研究显示胃腺癌中存在VM，且与分化程度有关，VM是胃腺癌不良预后的指标之一。

c-Met受体、p-Akt蛋白高表达患者VM显著高于低表达患者(P<0.05)，c-Met受体和VM的表达显著正相关(γ=0.277，P<0.05)，p-Akt蛋白和VM的表达显著正相关(γ=0.409，P<0.05)，表明c-Met受体、p-Akt蛋白与胃癌VM的生成存在显著相关性。而目前未见到这方面的相关报道，对于HGF/SF-Met信号通路与血管生成的关系，目前认为c-Met受体被配体激活后，羧基末端磷酸化为下游信号Src、Gab1、Grb2等提供停泊位点。HGF/SF-Met信号通路又可以激活多条信号传导通路，例如SRC-FAK通路、PI3K-AKT通路、RAS-RAF-MAPK通路等。其中，SRC-FAK通路可以调节细胞的粘附与迁徙，PI3K-AKT通路激活细胞的运动和抗凋亡作用，RAS-RAF-MAPK通路可以引起细胞播散及增值。这些下游信号通路直接或间接刺激血管的生成，此外HGF还可以引起VEGF的表达上调引起肿瘤的血管生成。

关于本研究中VM发生的分子机制，可能与下列通路有关。c-Met受体表达的上调引起PI3K-Akt信号通路的激活。活化的PI3K可以直接激活MT1-MMP，随后激活的MT1-MMP引起MMP-2蛋白的活化，进而分解细胞周围laminin5γ2。p-Akt蛋白的活化，可以诱导HIF-1α表达的上调。Pez等[8]的研究表明，PI3K-Akt信号通路的激活可以使p-Akt蛋白促进下游靶蛋白糖原合成酶激酶3(GSK-3)磷酸化，从而抑制HIF-1α降解，使HIF-1α表达增加，同时p-Akt蛋白又可以促进mTOR的表达，这也促进HIF-1α基因转录。HIF-1α表达的上调可以促进VEGF的表达。VEGF作为血管生成的主要调控因子，Vartanian等[9]的研究显示，抑制VEGF的表达可以显著抑制骨肉瘤VM的形成。5、VEGF还可以直接刺激VE-cadherin与EphA2的表达上调，进而促进VM的形成。Li等[10]研究显示，在存在VM的胃癌患者中HIF-1α和VEGF的表达显著高于无VM的胃癌患者。

胃癌组织中存在血管生成拟态，VM是肿瘤细胞为适应环境而产生的1种独特的血液供应模式，与内皮依赖性血管并存于胃癌组织内。

胃癌患者存在VM组与无VM组c-Met受体、p-Akt蛋白的表达存在显著差异，表面c-Met受体、p-Akt蛋白在胃癌VM发生中可能起重要作用。

参考文献

[1]Hess AR,Seftor EA,Gruman LM,et al.VE-cadherin regulates EphA2 in aggressive melanoma cells through a novel signaling pathway:implications for vasculogenic mimicry〔J〕.Cancer Biol Ther,2006,5(2):228-233.

[2]Duxbury MS,Ito H,Zinner MJ,et al.Ligation of EphA2 by Ephrin A1-Fc inhibits pancreatic adenocarcinoma cellular invasiveness〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2004,320(4):1096-1102.

[3]Hess AR,Postovit LM,Margaryan NV,et al.Focal adhesion kinase promotes the aggressive melanoma phenotype〔J〕.Cancer Res,2005,65(21):9851-9860.

[4]Giannelli G,Falk-Marzillier J,Schiraldi O,et al.Induction of cell migration by matrix metalloprotease-2 cleavage of laminin-5〔J〕.Science,1997,277(5323):225-228.

[5]Paulis YW,Soetekouw PM,Verheul HM,et al.Signalling pathways in vasculogenic mimicry〔J〕.Biochim Biophys Acta,2010,1806(1):18-28.

[6]刘文斌,许戈良,荚卫东，等.肝癌基质型血管生成拟态的表达及预后意义〔J〕.中华普通外科杂志,2012,27(2):111-114.

[7]李熳,谷彦军,张志广，等.血管生成拟态在胃腺癌中的临床病理意义和相关机制研究〔J〕.中国肿瘤临床,2010,37(7):372-376.

[8]Pez F,Dayan F,Durivault J,et al.The HIF-1-inducible lysyl oxidase activates HIF-1 via the Akt pathway in a positive regulation loop and synergizes with HIF-1 in promoting tumor cell growth〔J〕.Cancer Res,2011,71(5):1647-1657.

[9]Vartanian AA,Burova OS,Stepanova EV,et al.The involvement of apoptosis in melanoma vasculogenic mimicry〔J〕.Melanoma Res,2007,17(1):1-8.

[10]Li M,Gu Y,Zhang Z,et al.Vasculogenic mimicry:a new prognostic sign of gastric adenocarcinoma〔J〕.Pathol Oncol Res,2010,16(2):259-266.

(编辑：吴小红)

Relationship between Expression of c-Met and p-Akt and Vasculogenic Mimicry in

Gastric Cancer

SUHuiling,SUHonghui,CHENXueji,etal.HuabeiOilfieldGeneralHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity,Cangzhou,062552.

【Abstract】ObjectiveTo explore the correlation between p-Akt protein and HGF/c-Met pathway in gastric cancer and their association with vasculogenic mimicry (VM).MethodsAccording to the inclusion criteria and the exclusion criteria,a total of 74 cases of gastric cancer patients,and 16 cases of normal control patients were collected.The expression of c-Met receptor and p-Akt protein in the tumor tissues and the normal control group were detected by immunohistochemical method,CD-34 and PAS double staining were used to detect VM.ResultsThe expression of c-Met receptor and VM was significantly positively correlated(γ=0.277，P<0.05)，the p-Akt protein and VM was significantly positively correlated (γ=0.409，P<0.05)，indicated that the expression of c-Met receptor and p-Akt protein were significantly positively correlated with VM.ConclusionVM exists in gastric carcinoma.C-Met receptor and p-Akt protein may play important role in the occurrence of VM in gastric cancer.

【Key words】Gastric carcinoma;c-Met；p-Akt；Vasculogenic mimicry (VM)；Angiogenesis；Pathway

收稿日期(2015-06-12修回日期 2015-11-20)

中图分类号：R735.2

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)01-0043-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.013

通讯作者：苏红慧