转铁蛋白受体的单克隆抗体OX26偶联三氧化二砷免疫脂质体对鼠脑胶质瘤细胞系的体外抑制作用

陈　岩　郭美华　海　鑫　张　旭

转铁蛋白受体的单克隆抗体OX26偶联三氧化二砷免疫脂质体对鼠脑胶质瘤细胞系的体外抑制作用

陈岩郭美华海鑫张旭

【摘要】目的探讨转铁蛋白受体单克隆抗体(OX26)偶联三氧化二砷(As2O3)免疫脂质体对鼠脑胶质瘤细胞株的体外抑制作用。方法体外培养C6脑胶质瘤细胞，实验分为盐水组，As2O3(6 μmol·L-1)组和OX26偶联As2O3脂质体(6 μmol·L-1)组；采用四唑盐比色法(MTT)，检测OX26偶联As2O3免疫脂质体对脑胶质瘤细胞生长的抑制作用，DAPI染色观察OX26偶联As2O3免疫脂质体对脑胶质瘤细胞促凋亡的影响。免疫印迹法检测OX26偶联As2O3免疫脂质体对脑胶质瘤细胞胶质瘤胶质纤维酸性蛋白(GFAP)蛋白表达的影响。结果MTT比色法检测显示：OX26偶联As2O3免疫脂质干预对脑胶质瘤生长的抑制率为40.21%，显著高于As2O3组的25.77%，比较差异有统计学意义(P<0.05)；核染显示：与盐水组和As2O3组比较，OX26偶联As2O3免疫脂质组脑胶质瘤细胞的光密度和面密度值显著减少，比较差异有统计学意义(P<0.01)；Westernblot检测显示：OX26偶联As2O3免疫脂质组脑胶质瘤细胞GFAP蛋白的表达较盐水组和As2O3组少。结论OX26偶联As2O3免疫脂质体对鼠脑胶质瘤细胞具有明显的体外抑制作用，其作用机制可能与促进脑胶质瘤细胞凋亡和GFAP蛋白的表达相关。

【关键词】三氧化二砷；转铁蛋白受体的单克隆抗体；脑胶质瘤；胶质瘤胶质纤维酸性蛋白

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:007～009)

我们前期研究通过制备As2O3脂质体，并且证实As2O3脂质体可更显著地诱导鼠脑胶质瘤细胞凋亡，延长载瘤鼠的存活时间，其疗效优于单纯的As2O3治疗[1]。本研究在前期基础上，研究了转铁蛋白受体的单克隆抗体(OX26)偶联As2O3对C6 脑胶质瘤细胞体外生长的抑制作用，为临床应用奠定实验基础。

1材料与方法

1.1　材料

日本关西医科大学提供的大鼠C6脑胶质瘤细胞株；As2O3注射液(哈尔滨医科大学伊达制药厂)；注射级大豆卵磷脂(上海太伟药业)；胆固醇、维生素E粉、葡聚糖聚50水凝胶(Sigma 公司)；溴化二甲噻唑二苯四氮唑蓝(MTT)、多聚赖氨酸、二甲基亚砜购自Sigma公司；DMEM干粉培养基购自Gibco公司；胎牛血清为杭州四季青生物制品公司产品；山羊血清封闭液、DAPI、第一抗体为兔抗GFAP均购于博士德生物工程有限公司；兔抗β-Actin多克隆抗体为上海科兴生物科技公司产品，批号A10938R；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗为北京中杉金桥生物技术公司产品，批号A0208；倒置相差显微镜(OLYMPUS，IX70-S8F)；酶标仪AD340型( BECKMAN 公司)。

1.2　实验方法

1.2.1As2O3脂质体制备[1]将卵磷脂、胆固醇和维生素E按照20∶5∶1的比例称量，放置于茄形瓶，加入适量氯仿溶解，均匀混合，40 ℃减压旋转蒸发；精密称取适量As2O3，于去离子水中加热溶解，制成溶度为1 mg/mL的As2O3溶液，将该溶液加入上述磷脂和胆固醇脂质膜的茄形瓶中，旋转水化15 min，冰浴超声，得到As2O3脂质体溶液，通过具体的超声时间和强度制成粒径为0.25～1 μm的单层脂质体。As2O3脂质体的包封率参照《中华人民共和国药典》采取银盐法测定[2]。

1.2.2OX26偶联As2O3免疫脂质体制备将转铁蛋白受体抗体 OX26 按照 Traut's 试剂盒的实验步骤巯基化，将As2O3脂质体冻干产品以蒸馏水重分散，加入巯基化的 OX26，室温下氮气保护进行偶联反应，得到OX26偶联As2O3免疫脂质体制备。

1.2.3C6脑胶质瘤细胞培养及处理[3]用含10 ml/L新生牛血清的DMEM培养基培养：C6细胞分装于培养瓶，加入适量DMEM培养液，置入37 ℃恒温恒湿培养箱，培养生长至所需的细胞数，在细胞对数生长期大约80%时，用0.25 mL/L胰酶消化，离心，Hank's液吹打制成细胞悬液，接种。苔盼蓝排斥试验检测细胞活力大于95%，接种前，收获指数生长期的大鼠C6胶质瘤细胞，加入细胞悬浮，终浓度为每15 μL含2×106个C6胶质瘤细胞，再接种于12孔板或96孔板。

1.2.4实验分组实验随机将培养的C6胶质瘤细胞分为3组：盐水组，As2O3组和OX26偶联As2O3脂质体组。分别给予生理盐水、As2O3液(6 μmol·L-1)和OX26偶联As2O3免疫脂质(6 μmol·L-1)进行干预；1次/d，3组均干预2周；然后进行相关指标检测。

1.2.5MTT检测[4]在脑胶质瘤细胞终止培养前3 h ，每孔加入MTT溶液20 μl，常规继续培养3 h，吸去孔板内液体，加DMSO液，于摇床轻摇10 min，采用酶标仪在波长492 nm设置下检测每孔脑胶质瘤细胞OD值。细胞抑制率(%)= [(对照组OD 值-治疗组OD 值)/对照组OD 值]×100%。

1.2.6脑胶质瘤细胞凋亡检测采取细胞核(DAPI)染色法，吸取3组培养板内的液体，分别加入DAPI(1∶1 000)各1 mL，5 min，用PBS漂洗3次，荧光显微镜下观察和拍照。图片处理采用C8图像分析仪，每组细胞随机选择10张图片检测，每张图片随机选取10个视野，记录每个视野下细胞光密度和面密度值。

1.2.7免疫印迹法检测无菌条件下细胞经裂解，BCA法蛋白定量，蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳分离，硝酸纤维素膜进行转膜和封闭，一抗兔抗GFAP(1∶8 000)孵育过夜，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶2 500)孵育，蛋白条带用化学发光法显示，胶片显影、定影；采用β-actin作为内参。图片分析应用NIH Image软件。

1.3　统计学方法

2结果

2.1　OX26偶联As2O3免疫脂质对脑胶质瘤抑制作用

MTT 法检测显示：相对于盐水组，两组干预后脑胶质瘤细胞的OD值分别为0.72±0.18和0.58±0.12，明显小于盐水组(P<0.01)；与As2O3组比较，OX26偶联As2O3免疫脂质干预对脑胶质瘤生长的抑制率为40.21%，显著高于As2O3组的25.77%，比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表 1。

表1　OX26偶联As2O3免疫脂质对脑胶质瘤生长的抑制

2.2　OX26偶联As2O3免疫脂质促进脑胶质瘤凋亡

核染显示：相对于盐水组，两组干预后，脑胶质瘤细胞的核染色明显减少。与As2O3干预比较，OX26偶联As2O3免疫脂质组脑胶质瘤细胞的光密度和面密度值显著减少，比较有统计学意义(P< 0.01)，见表 2。

2.3　OX26偶联As2O3免疫脂质对脑胶质瘤细胞GFAP蛋白表达影响

GFAP蛋白Western blot检测显示：盐水组GFAP蛋白表达量较干预组少，而OX26偶联As2O3免疫脂质组GFAP蛋白表达量最多，见图1。

表2　OX26偶联As2O3免疫脂质对脑胶质瘤细胞凋亡的

图1　蛋白印迹法检测各组脑胶质瘤细胞中GFAP的表达

3　讨论

胶质瘤呈浸润性分布，手术治疗未能将其彻底清除，易复发，且术后的放化疗对患者的损害大[5]。探索新的有效治疗方法和药物是亟待解决的临床难题。

As2O3作为传统中药砒霜的有效成份，已广泛用于临床白血病手术的化疗。但是，单纯的砷剂有治疗代谢快、效用时间较短等缺点[6]。研究证实，脂质体具有对癌细胞的靶向性高，毒副作用低，药效高和生物降解性和生物相容性好等特点[1]。脂质体能够延缓药物清除，有利于向病变组织分布，且局部靶向作用可极大提高药物的作用疗效[7]。研究表明，转铁蛋白受体大量位于肿瘤细胞的表面，是肿瘤靶向转运的重要靶标[8]。体内内源性转铁蛋白的含量较高，与受体的结合接近饱和水平，所以转铁蛋白本身并不适合作为转运体。在本研究中，我们通过合成OX26偶联As2O3脂质体，极大提高了干预效果。本研究结果显示，OX26偶联As2O3脂质体对胶质瘤细胞体外具有明显抑制作用，且能够促进胶质瘤细胞的凋亡，上述作用均优于单纯的As2O3干预。

研究治疗方法和药物干预对脑胶质瘤细胞的作用机制对临床治疗具有重要价值。GFAP为中间丝蛋白，特异性表达于胶质瘤细胞[9]。胶质瘤细胞GFAP的强阳性表达往往标志着瘤细胞趋向于好[10]。研究进一步发现，GFAP与胶质瘤细胞的分化程度密切相关，即分化程度越差，GFAP表达越少甚至不表达[11]。在本研究中发现，OX26偶联As2O3脂质体对胶质瘤体外干预后，GFAP蛋白表达较盐水对照组合单纯As2O3作用更多。提示了OX26偶联As2O3脂质体对胶质瘤细胞体外抑制作用的作用机制。

参考文献

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(编辑：吴小红)

Inhibitory Effect of OX26 and As2O3Immunoliposome on Viability of

Glioma Cell in Rats in Vitro

CHENYan,GUOMeihua,HAIXin,etal.TheFirstHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin,150001

【Abstract】ObjectiveTo observe the inhibitory effect of OX26 and As2O3immunoliposome on viability of glioma cell in rats in vitro.MethodsC6 glioma cells were cultured in vitro and divided into saline water group,As2O3group,and combination group of OX26 and As2O3immunoliposome.MTT colorimetric method was used to detect inhibitory effect of combination of OX26 and As2O3immunoliposome on viability of glioma cells.DAPI staining was used to observe apoptosis of combination of OX26 and As2O3immunoliposome on glioma cells.Western blot method was used to evaluate expression of glial fibrillary acidic protein(GFAP) combination of OX26 and As2O3immunoliposome on glioma cells.ResultsMTT method showed inhibitory rate of combination of OX26 and As2O3immunoliposome on glioma cells was 40.21%,which was higher than As2O3group 25.77%(P<0.05).Compared with saline water group and As2O3group,optical density and areal density of glioma cells in combination group of OX26 and As2O3immunoliposome were obviously decreased by DAPI staining(P<0.01).Western blot method showed that GFAP expression in combination group of OX26 and As2O3immunoliposome was less than saline water group and As2O3group.ConclusionInhibitory effect of combination of OX26 and As2O3immunoliposome on viability of glioma cell rats in vitro is remarkable,and its mechanism may be related with promote apoptosis and GFAP expression of glioma cells.

【Key words】As2O3；OX26；Glioma；Glial fibrillary acidic protein(GFAP)

中图分类号：R730.264

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)01-0007-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.003

通讯作者：张旭

基金项目：作者单位:150001 哈尔滨医科大学附属第一医院

收稿日期(2015-01-09修回日期 2015-05-04)