结核感染T细胞斑点试验对肺外结核诊断的临床意义

田　洹，胡文斌，毛艳军

(1.甘肃中医药大学附属医院检验科，甘肃兰州 730020；2.甘肃中医学院2013级硕士研究生，甘肃兰州 730000)



·临床研究·

结核感染T细胞斑点试验对肺外结核诊断的临床意义

田洹1，胡文斌2，毛艳军1

(1.甘肃中医药大学附属医院检验科，甘肃兰州 730020；2.甘肃中医学院2013级硕士研究生，甘肃兰州 730000)

摘要:目的评价结核感染T细胞斑点试验(T-spot.TB试验)对外周血中结核分枝杆菌检测的临床意义。方法对2014年5月至2015年5月在甘肃中医学院附属医院治疗的疑似结核病患者及体检志愿者分成两组，进行对照研究，抽取外周静脉血采用T-spot.TB诊断试剂盒进行检测。结果肺外结核组阳性者38例，阳性率为95%(38/40)，阴性者2例，阴性率为5%(2/40)。健康对照组40例，阳性者0例，阳性率为0%(0/40)，阴性者40例，阴性率为100%(40/40)。灵敏度为95%(38/40)，特异度为100%(40/40)。肺外结核组阳性率大于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论T-spot.TB试验对肺外结核有高度的敏感性和特异性，可以作为临床判断是否存在结核感染的检测筛查手段之一，值得临床推广。

关键词:结核感染T细胞斑点试验；肺外结核；临床意义

结核病是危及人类健康的传染病之一，我国是仅次于印度的第2结核大国，且近年有上升趋势。结核分枝杆菌可侵犯全身各个系统，比较多见的有肺结核、骨结核、结核性胸膜炎、淋巴结核、肠结核等，且肺外结核发病往往十分隐匿，给临床的诊断和治疗带来了极大的困难。传统的检测方法存在许多不足，随着基因分子生物学的发展，更好的检测手段应运而生，结核感染T细胞斑点试验是检测结核感染的最新方法。T-spot.TB使用结核分枝杆菌特异性抗原刺激外周血单个核细胞，通过细胞因子γ-干扰素的分泌检测抗原特异性T淋巴细胞的应答反应，从而判断结核感染的状态，具有良好的敏感性和特异性。现对在本院治疗的肺外结核感染患者与体检的健康志愿者进行对照研究，拟探讨T-spot.TB试验对肺外结核诊断的临床意义，现将结果报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料A组(肺外结核组)：选取2014年5月至2015年5月在甘肃中医学院附属医院治疗的肺外结核患者共40例，年龄18～80岁，平均43.3岁，所有患者均进行影像学检查及结核免疫学检查，疑似结核，其中淋巴结核14例、结核性胸膜炎9例、腰椎结核8例、结核性腹膜炎7例、支气管结核2例。B组(健康对照组)选取在本院体检的健康志愿者40例，健康组均无陈旧性结核，亦进行影像学检查及结核免疫学检查，排除感染结核。整个过程由专门经过培训的人员负责完成并控制质量。

1.2实验试剂T-SPOT.TB试剂盒由上海复星长征医学科学有限公司提供。

1.3方法

1.3.1淋巴细胞的提取、计数及铺板抽取肝素钠抗凝静脉血5 mL，颠倒混匀，再加入1640至满，混匀备用。于每支15 mL无菌离心管中加入3 mL淋巴细胞分离液，将混匀的全血缓慢加入淋巴分离液上层约10 mL，离心机刹车档调至2档，离心速度2 400 r/min 离心22 min，用一次性吸管吸取白膜层至另一离心管中，加1640至10 mL，颠倒混匀2次，再次以1 800 r/min离心7 min，去掉上清液，手工拍打沉淀，再加入1640至10 mL，最后一次以1 400 r/min离心7 min，倒掉上清液，每管加入600 μL AIM-V培养液，用枪吹匀细胞沉淀，取200 μL加入EP管中进行白细胞计数，根据(测得白细胞数-2.5)×200，稀释所有标本数至每毫升2.5×106个(每毫升低于2.5×106个可能影响实验结果)，按照计算数值加入AIM-V培养液至各标本管中，稀释后即可进行铺板，每人份4孔，分别加入50 μL阳性对照、A抗原、B抗原和阴性对照，再加入100 μL稀释混匀的细胞悬液，混匀后放入二氧化碳(CO2)培养箱培养18～22 h。

1.3.2显色按照每人份8 mL磷酸盐缓冲液(PBS)用量将PBS 10倍浓缩液用蒸馏水稀释，用配好的PBS应用液稀释酶标二抗抗体，每人份1 μL酶标二抗抗体，200倍稀释配成工作液。将培养板从CO2培养箱内取出，甩掉孔内液体，每孔用PBS洗涤4遍，拍干，每孔加入50 μL酶标二抗抗体工作液，放置4～8 ℃冰箱内孵育1 h，取出后用PBS洗涤4遍，拍干，每孔加入50 μL显色液，CO2培养箱放置5～7 min，出现清晰斑点后用蒸馏水冲洗4遍，拍干，风干5～10 min。

1.4结果的判断

1.4.1阳性结果(1)空白对照孔数为0～5个时且抗原A或抗原B孔的斑点数减法空白对照孔斑点数大于或等于6；(2)空白对照孔数为6～10个时且(抗原A或抗原B孔的斑点数≥2)×(空白对照孔斑点数)。

1.4.2阴性结果不符合上述阳性结果且PHA对照孔正常则结果为阴性。

1.5统计学处理检验结果用例数或百分率表示，采用χ2检验方法，应用SPSS21.0进行数据分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

肺外结核组阳性者为38例，阳性率为95%(38/40)，阴性者为2例，阴性率为5%(2/40)。健康对照组40例，阳性者为0例，阳性率为0%(0/40)，阴性者为40例，阴性率为100%(40/40)。灵敏度为95%(38/40)，特异度为100%(40/40)。肺外结核组T细胞反应阳性率大于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1　　结核分枝杆菌抗原特异性T细胞反应频率

3讨论

世界卫生组织2004年的报告显示，结核病诊断率仅为37%，即使在发达国家也仅有50%的结核病例得到细菌学确诊[1]，而肺外结核病变部位多变、症状不典型，相对于肺结核诊断难度又更大。目前，临床诊断结核的方法存在许多不足，如：结核菌素试验一直是诊断结核菌感染的重要方法，具有操作简单，成本低廉的优势，但存在特异性及敏感性较低的缺陷，在结核感染免疫力低下人群中，其敏感性降低。由于结核菌素纯蛋白的衍生物(PPD)是200多种蛋白的混合物，其中很多是非结核分枝杆菌(BCG)的共同抗原成分，在普通接种BCG的地区造成非常高的假阳性。而其他检测方法如细菌学检查作为诊断结核的金标准，其细菌培养费时长一般需要2个月，可能延误治疗的最佳时间；抗酸染色试验检出率较低；组织病理学为有创伤性操作；影像学诊断缺乏特异性。随着基因分子生物学的研究发展，发现机体受到结核分枝杆菌感染后，引发固有免疫和获得性免疫，由于机体长期存在特异性的中央型及效应型记忆细胞，当抗原刺激机体时，这些记忆迅速活化增殖并释放γ-干扰素。因此，通过某种技术检测机体内经结核刺激后释放γ-干扰素的数量，即可推断出是否存在结核分枝杆菌感染。而T-spot.TB试验是检测结核感染的最新方法，它可以检测出1/100 000～1/50 000的外周血中单核细胞中经抗原刺激后释放细胞因子的细胞，目前已成为最敏感的检测方法[2]。大量研究表明T-spot.TB试验检测对肺外结核感染具有较高的敏感性和特异性。如Kim等[3]对疑似肺外结核患者72例进行前瞻性研究，结果T-spot.TB检测对肺外结核的敏感性为94%，明显高于结核菌素试验(47%)，其中47例有免疫抑制性疾病，这也是结核菌素试验阳性较低的原因之一。Dai等[4]Meta分析结果提示T-spot.TB试验敏感性和特异性分别为88%和89%。王永生等[5]对其医院26例疑似结核性脑膜炎与23例无结核原发病灶的脑膜炎患者做脑脊液T-spot.TB试验检查，进行对照研究，结果发现其灵敏度为88.5%，特异度为83.3%，对诊断结核性脑膜炎有用。荣兰香等[6]对其医院268例疑似结核病患者进行T-spot.TB试验和PPD试验进行比较，结果发现T-spot.TB试验比结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)试验的敏感性和特异性要高，且假阳性率和假阴性率要低，可为临床诊断结核病患者提供早期诊断依据。聂力平等[7]比较了T-spot.TB试验与结核菌素试验两种检测法，结果发现T-spot.TB试验的灵敏度和特异度高于结核菌素试验，且假阳性率和假阴性率低于结核菌素试验。刘珍琼等[8]研究发现用T-spot.TB试验检测外周血和胸腔积液中单个核细胞结核杆菌感染有助于提高结核性胸膜炎的诊断率．而且胸腔积液中单个核细胞T-spot.TB试验敏感性和特异性高于外周血。采用T-spot.TB试验检测结核性心包积液、结核性腹膜炎、结核性胸膜炎、结核性腹水、脊柱结核、肠结核、肾结核都有相关报道且检测结果较好，特异度和灵敏度皆比其他结核杆菌检测方法要高。

本次研究结果表明T-spot.TB对肺外结核的诊断，其灵敏度为95%，特异度为100%。其中肺外结核组有2例检测为阴性，考虑可能与患者抗结核治疗效果有关，也有可能与个别体质有关，也可能确实未有结核感染。健康对照组选择的是没有结核病史或接触史的研究对象，检测结果全部阴性，说明T-spot.TB试验对肺外结核检测结果是肯定的，也有可能与这次试验的样本量较小有关。本次T-spot.TB试验采外周静脉血检查，只能检测出是否有结核杆菌的存在，并不能定位结核病灶。在痰结核菌检测阴性、胸部CT诊断阴性病例中诊断意义较大[9]。所以当采血做T-spot.TB试验检查时发现阳性者，再结合X线片、CT或痰培养检查，即可基本确定感染结核病灶的位置了。由此可见T-spot.TB试验静脉采血检查可用于职业暴露合并结核病的定期检测筛查，可作为临床判断是否存在结核感染的检测筛查手段之一。有利于更好地用于肺外结核的辅助诊断。所以，T-spot.TB检测对肺外结核具有重要的临床意义，值得临床推广。

参考文献

[1]乐军，梁莉，李苏辉，等.酶联免疫斑点试验快速诊断结核分枝杆菌感染的临床应用价值[J].中华检验医学杂志，2006，29(11)：1005-1008.

[2]刘晓清，张丽帆.γ-干扰素释放分析T-spot.TB诊断结核感染中的研究进展[J].中国实验诊断学，2012，1(12)：2065-2068.

[3]Kim SH，Chois J，Kim HB，et al.Diagmostic userulness of atcell based assay for extrapu lmonary tuberculoss[J].Arch Zntern Med，2007，167(20)：2255-2259.

[4]Dai Y，Feng Y，Xu R，et al．Evaluation of interferon-gamma release assays for the diagnosis of tuberculosis：An updated meta-analysis[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2012，11(31)：3127-3137．

[5]王永生，周航，刘蔺，等．T-spot.TB试验在结核性脑膜炎诊断中的价值[J].中国卫生标准管理，2014，5(1)：68-71．

[6]荣兰香，马淑红，艾清，等．T-spot.TB试验与PPD试验对结核病患者诊断价值相关性比较[J].中国实验诊断学，2013，17(8)：1475-1476.

[7]聂力平，宋育明．T细胞斑点试验与结核菌素试验检测结核病的比较[J].福建医药杂志，2014，36(1)：80-82.

[8]刘珍琼，段永和，张齐龙，等.T-spot.TB试验技术检测胸腔积液在结核性胸膜炎诊断中的应用[J].实验与检验医学，2013，31(4)：306-308.

[9]陈旭君，黄溢华，崔会芳，等.52例结核感染T细胞斑点试验与痰结核茵检测及CT诊断肺结核病的对比观察分析[J/CD].中华肺部疾病杂志：电子版，2014，7(4)：417-418.

(收稿日期：2015-07-12)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.01.054

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)01-0114-02