APP下载

鸭瘟与鸭坦布苏病毒病活疫苗联合免疫效果研究

2016-02-24韩建文申茂欣蔡联燊楚电峰李凯善夏娜杜元钊

水禽世界 2016年2期

韩建文 申茂欣 蔡联燊 楚电峰 李凯善 夏娜 杜元钊

摘 要:鸭瘟鸡胚化弱毒活疫苗与鸭坦布苏病毒病活疫苗通过肌肉注射途径,同时接种21日龄健康易感肉鸭,检测两种活疫苗联合免疫的安全性和免疫效力。将两种活疫苗同时免疫雏鸭,免疫后14d检测血清抗体值,并在14d时采用鸭瘟强毒和鸭坦布苏病毒强毒株同时攻毒,观察试验组与对照组的攻毒保护情况。结果表明:两种活疫苗联合免疫健康易感雏鸭后,血清抗体上升快,可同时抵御鸭瘟强毒与鸭坦布苏病毒强毒株的攻击,保护效果良好。结论:鸭瘟与鸭坦布苏病毒病活疫苗联合免疫,对雏鸭安全,免疫保护效果好,避免多次免疫对雏鸭带来的应激反应,提高养殖经济效益。

关键词:鸭瘟;鸭坦布苏病毒;联合免疫

中图分类号:S858.322.4 文献标识码:B 文章编号:1673-1085(2016)02-0037-06

鸭瘟是由鸭瘟病毒引起的一种急性接触性传染病,是危害养鸭业的最重要疾病之一,该病流行广泛,传播迅速,其特征为血管破坏、组织出血、淋巴器官损伤和实质器官变性。病鸭体温升高,两腿麻痹、下痢、流泪和部分病鸭头颈肿大;食道粘膜有小出血点,并有灰黄色假膜覆盖或溃疡,泄殖腔粘膜充血、出血、水肿和假膜覆盖[1]。早在1923年荷兰已有鸭瘟流行,以后在印度、比利时、意大利、英国、法国、德国和加拿大也有发现,1967年在美国东海岸流行,称为鸭病毒性肠炎(Duck virus enteritis,DVE),我国1957年首次报道本病,目前我国采用的鸭瘟鸡胚化弱毒活疫苗保护雏鸭免受强毒攻击,效果良好。鸭坦布苏病毒病是新发现的一种以蛋鸭产蛋下降为主要特征的传染病,目前尚没有商品化的疫苗可预防和控制该病。中国农业科学院上海兽医研究所联合青岛易邦生物工程有限公司最新研制的鸭坦布苏病毒弱毒活疫苗(FX2010-180P 株),能有效保护雏鸭抵御强毒攻击,且对雏鸭安全,无任何免疫副反应[2]。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 RNAiso Plus、RNA酶抑制剂(RRI)、M-MLV反转录酶、DL2000DNA分子量标准购自大连宝生物(Takara);PCR Mix(广州东盛生物科技有限公司);75%乙醇(用DEPC处理过的水配制)、无RNase的水、分析纯的氯仿、异丙醇和乙醇;鸭坦布苏病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒由中国农业科学院上海兽医研究所提供。

1.2 毒种和细胞 鸭坦布苏病毒疫苗毒(FX2010-180P株)、检验用毒(FX2010株)及DF1细胞系由中国农业科学院上海兽医研究所提供;鸭瘟鸡胚化弱毒株和鸭瘟检验用强毒由青岛易邦生物工程有限公司提供。

1.3 引物设计[4] 根据坦布苏病毒(FX2010)E基因序列设计两对特异性的重叠引物:

P1: 5'-AGACTGCTGGTGCAATGAGAC-3';

P2: 5'-CGGTACCATAATCCTCCATCTCAGC-3';

P3: 5'-CATAGGCTGGAATCTGGGAAC-3';

P4: 5'-TCTGGATTCTGTCGTCACGTC-3'引物由上海Invitrogen公司合成,用DEPC水稀释至终浓度为10μmol/L,分装后冻存于-20℃。

1.4 病毒RNA的提取 取1.5ml Eppendorf管,向其内加入500μl待检病毒液、800μl Trizol(Invitrogen),静置5min;加入0.2ml氯仿,振荡15S,静置2~3min;4℃离心10min,吸取上清并加入等体积的异丙醇,沉淀10min;4℃ 10800×g离心10min,弃上清,用75%酒精清洗沉淀,混匀后,10800×g离心10min;倒掉上清,RNA自然干燥,用20μl DEPC水溶解RNA。

1.5 反转录 将5μl RNA提取液与2μl Random 9(TaKaRa)混匀,70℃保温10min,迅速冰浴2min,然后分别加入4μl 5×AMV Buffer、1μl RRI、1μl AMV(Takara)、lμl 10μmol/L dNTP、6μl DEPC水,共20μl,混匀后30℃保温10min,42℃ lh,75℃ 10min。

1.6 套式RT-PCR方法的建立 第一轮PCR采用25μl反应体系:l2.5μl PCR Mix,1μl P1(10 μmol/L),lμl P2(10μmol/L),1μl cDNA模板,灭菌ddH2O补加至25μl。置于PCR仪中,94℃预变性4min;94℃变性30S,53℃退火30S,72℃延伸lmin,进行25个循环;最后72℃延伸10min。1.0%琼脂糖凝胶电泳,并用凝胶成像系统进行拍照。第二轮PCR采用25μl体系:取第一轮PCR反应液1μl为模板,12.5μl PCR Mix、lμl P3(10μmol/L)、lμl P4(10μmol/L),灭菌ddH2O补加至25μlL,置于PCR仪中。94℃预变性4min;94℃变形30S,53℃退火30S,72℃延伸30S,进行25个循环;最后72℃延伸10min。1.0%琼脂糖电泳,阳性样品应该出现299bp特异性条带,并用凝胶成像系统进行拍照。

1.7 试验动物 SPF胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司;21日龄商品肉鸭购自寿光某养殖场。

1.8 活疫苗的制备

1.8.1 鸭瘟活疫苗制备 鸭瘟鸡胚化弱毒株用灭菌PBS(0.01mol/L,pH7.2)100倍稀释后经过绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚,0.2ml/枚,37℃孵育,收集48~120h死亡的鸡胚,置2~8℃冷却后,收获死亡胎儿,经研磨、冻融及80目滤网过滤后上清液加入一定比例的5%蔗糖脱脂奶稳定剂冻干制备1000羽/瓶规格的疫苗。

1.8.2 鸭坦布苏病毒病活疫苗制备 鸭坦布苏病毒疫苗毒(FX2010-180P株)接种单层原代鸡胚成纤维细胞,37℃孵育,待细胞出现70%以上CPE时,收获病毒液,加一定比例的明胶蔗糖保护剂冻干制备200羽/瓶规格的疫苗。

1.9 疫苗安全性观察 32只21日龄商品肉鸭随机分成4组,8只/组,分别标记为A、B、C、D组,按如下分组进行免疫,免疫后连续观察14d,记录试验鸭采食、精神状态及14d后剖检脏器的病变情况,见表1。

1.10 免疫与攻毒 将43只21日龄经过检测鸭坦布苏及鸭瘟抗原、抗体均阴性的商品肉鸭随机分成4组,分别标记为E、F、G、H组,按如下分组进行编号和免疫,分别于免疫前和免疫后14d,脚跟静脉釆血监测抗体水平,并于免疫后14d按试验分组分别攻击相应毒株,持续观察16d,记录试验鸭采食、精神状况。其中攻击鸭坦布苏强毒的试验鸭(连同对照组)从攻毒后第4天开始每隔3d采血2只并处死取脾、肺、肾及脑部脏器进行病毒分离,而攻击鸭瘟组在攻毒结束采集脾脏和脑部组织进行病毒分离和PCR检测,见表2。

1.11 鸭坦布苏病毒PCR检测 将采的脾脏按1g加1ml PBS的比例研磨,按1.4~1.6操作进行PCR检测。

1.12 病毒分离 将同一试验动物采集脏器组织混合研磨,4℃ 8000rpm离心10min取上清,按终浓度100IU/ml加入青链霉素,其中鸭瘟攻毒组处理后的组织液经过绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚,每个样品接种3枚,0.2ml/枚,37℃孵育120h,对未死亡鸡胚进行盲传一代,观察鸡胚死亡情况;鸭坦布苏病毒攻毒组处理的组织液接种DF1细胞进行病毒分离,将70%长满的48孔细胞单层弃液后用无血清DMEM清洗3遍,每孔加入待检组织毒10μl,每个样品加3孔,37℃细胞培养箱感作1.5h,每孔补加2%胎牛血清DMEM200μl,培养6d,盲传2代观察细胞病变情况。

2 结果

2.1 试验疫苗质量检测 鸭瘟活疫苗:104.13ELD50/羽[3],鸭坦布苏毒活疫苗:104.0TCID50/羽。

2.2 疫苗安全性观察结果 从表3“疫苗安全性观察结果”和表4“安检动物剖检结果”来看,鸭瘟活疫苗和鸭坦布苏病活疫苗无论单独使用还是两者联合使用于21日龄商品肉鸭,均未对商品肉鸭造成采食、精神状态以及内部脏器等的损害,说明两种疫苗联合使用是安全的。

2.3 免疫与攻毒前后鸭坦布苏抗体监测 从表5“免疫与攻毒前后鸭坦布苏抗体检测结果”来看,试验鸭在经历含鸭坦布苏病活疫苗免疫及鸭坦布苏强毒攻击前后,鸭坦布苏ELISA抗体阻断率均有不同程度的升高,其中F组(鸭坦布苏病活疫苗单苗)与G组(鸭坦布苏病活疫苗+鸭瘟活疫苗联合使用)在免疫前后ELISA抗体阻断率虽然均为全部转阳,但阻断率为G组优于F组;而经过鸭坦布苏强毒攻击14d后,H组ELISA抗体阻断率上升幅度最高,相对而言G组上升幅度低于其他各组,说明鸭坦布苏病活疫苗+鸭瘟活疫苗两种疫苗联合使用不但不相互抑制反而起到互补作用。

2.4 攻毒观察结果 从表6“鸭瘟攻毒组攻毒后观察结果”和表7“鸭坦布苏攻毒组攻毒后观察结果”来看,鸭瘟活疫苗和鸭坦布苏病活疫苗无论单独使用还是两者联合使用,均能耐受鸭瘟和鸭坦布苏病毒强毒株的攻击,均未表现出特异性临床症状,攻击鸭瘟强毒对照组试验动物(H1~H4)从攻毒后第5天开始出现发病或死亡现象并于第9天全部死亡;攻击鸭坦布苏强毒对照组试验动物(H5~H14)从攻毒后第2天开始出现共济失调现象并持续到第9天,累计发病比例达9/10(90%)。

2.5 病毒分离结果 从表8“鸭瘟攻毒组病毒分离结果”和表9“鸭坦布苏病毒攻毒组病毒分离结果”来看,无论两种疫苗单独使用还是联合使用,免疫组攻毒后均不能从脏器中分离到病毒,而攻毒对照组只有鸭坦布苏对照组有1只未分离到病毒外其余均分离到病毒。

2.6 鸭坦布苏攻毒组脏器PCR检测 见图1。从鸭坦布苏病毒攻毒组攻毒后脾脏含毒PCR检测结果来看对照组除1只(H13)外其余发病个体均检测到病毒,而鸭坦布苏单苗组和鸭瘟与鸭坦布苏联合免疫组在攻毒后7内检测到病毒但7d以后无法检测。结合病毒分离结果,表明该检测毒不具活性,无法进行病毒复制。

3 讨论

3.1 疫苗安全性 突出两种疫苗联合免疫对肉鸭不产生副反应。

在畜牧业养殖中,疫苗的安全性尤为重要,疫苗的安全性极大地限制了疫苗的使用。在本研究中,对21日龄商品肉鸭免疫鸭瘟活疫苗与鸭坦布苏病活疫苗,观察肉鸭所产生的副反应,结果表明:联合免疫这两种疫苗,并不会产生不良副反应。具有单独免疫的安全性。这为鸭瘟活疫苗与鸭坦布苏病活疫苗两种疫苗的联合免疫奠定基础。

3.2 疫苗联合免疫作用 在疫苗安全性得到保证的前提下,保证免疫效果是疫苗使用的又一重要目标。鸭瘟活疫苗与鸭坦布苏病活疫苗两种疫苗联合免疫,从血清抗体结果上来看,高于单独免疫的抗体。并且对鸭坦布苏攻毒后脾脏含毒PCR检测及病毒分离结果来看,联合免疫有助于疫苗抗体提升。这说明,联合免疫这两种疫苗,减少了免疫次数,但是却能获得比单独免疫更高的抗体水平。

3.3 客户的使用选择 疫苗的宗旨是安全、有效、方便。本研究中,我们对比了联合免疫鸭瘟活疫苗与鸭坦布苏病活疫苗。该方法既保证了使用的安全性,又提高了抗体水平,减少了免疫次数,真正做到了安全、有效、方便。为水禽养殖户在鸭瘟和鸭坦布苏病毒病的预防提供科学依据。

参考文献:

[1] 蔡宝祥.家畜传染病学[M].中国农业出版社,第四版2001:330-333.

[2] 吴晓刚,高旭元,余磊,等.鸭坦布苏病毒活疫苗(FX2010-180P株)毒种保存期的研究[J].中国动物传染病学报,201422(3):14-18.

[3] 陈樨,陈晟生.鸭瘟活疫苗鸡胚效检与免疫攻毒保护的平行关系[J].福建畜牧兽医,2010,32(6):29-30.

[4] 颜丕熙,李国新,吴晓刚,等.应用套式RT-PCR快速检测鸭坦布苏病毒[J].中国动物传染病学报,2011,19(3):34-37.