春石斛类原球茎克隆增殖技术研究

2016-02-23朱志国

宿州学院学报 2016年8期

关键词：原球茎褐化静置

朱志国

芜湖职业技术学院园林园艺学院，安徽芜湖，241003

春石斛类原球茎克隆增殖技术研究

朱志国

芜湖职业技术学院园林园艺学院，安徽芜湖，241003

以春石斛(Dendrobiumnobile)茎尖诱导的无菌类原球茎作为外植体，在2/1 MS培养基中添加不同浓度的NAA和6-BA，采用不同的培养方式和培养时间，设置不同的pH值等，对春石斛类原球茎克隆增殖技术进行了系统探讨。结果显示，采用1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1培养基配方对春石斛类原球茎克隆增殖效果最好。不同培养方式之间春石斛类原球茎增殖系数差异明显，液体培养较固体培养、半固体培养效果好；液体培养中以液体振荡培养，同时添加活性炭为最佳。试验还表明，春石斛类原球茎的增殖率与培养时间成一定线性相关。经液体培养20 d，春石斛类原球茎数量增殖多，且没有明显的褐化现象，其中培养基pH值设为5.5最适宜。

春石斛；类原球茎；增殖

春石斛(Dendrobiumnobile)属兰科附生兰，是花卉中名贵的花卉之一[1-2]，由于在春季开花，故名春石斛。春石斛一般采用类原球茎繁殖新个体，但增殖率低[3-4]，学界对类原球茎培育形成后如何克隆增殖的探讨报道不多，采用液体培养进行克隆增殖的相关研究很少。本试验采用春石斛培育形成的类原球茎为主要试材，研究植物生长调节物质种类及其浓度、培养方式等对春石斛克隆的效果，以探讨春石斛类原球茎克隆增殖的最佳途径，为规模化生产春石斛优良种苗提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以分离的春石斛茎尖作为外植体培育形成的类原球茎。

1.2 试验方法

1.2.1 不同激素组合对春石斛类原球茎克隆增殖的影响

基本培养基为1/2 MS，NAA浓度设0、0.5、1.0、2.0 mg·L-1，分别添加6-BA 0.5、1.0 mg·L-1和KT 0.05、0.10、0.20、0.50 mg·L-1。每处理接种10瓶，每瓶接种15块类原球茎。

以上材料培养45 d后进行克隆系数统计，以类原球茎增殖总数/接种类原球茎数计算[5-6]。

1.2.2 培养方式对春石斛类原球茎克隆增殖的影响

1.2.2.1 液体、半固体、固体培养方式比较

把诱导形成的类原球茎分别接种于添加7.0 g、3.5 g琼脂的培养基和不添加琼脂的培养基中进行培养。每处理接种10瓶，每一瓶大约接种2.0 g类原球茎。

以上材料培养20 d后进行克隆系数统计，以类原球茎重量增加数/接种类原球茎重量计算。

1.2.2.2 液体振荡、液体静置、添加活性炭、不添加活性炭比较

将诱导形成的春石斛类原球茎分别进行振荡、静置培养、加入活性炭液体振荡培养和加入活性炭液体静置培养4种处理。培养基成分为1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+6BA 0.5 mg·L-1。每处理接种10瓶，每一瓶接种大约2.0g类原球茎。

以上材料培养20 d后进行克隆系数统计，以类原球茎重量增加数/接种类原球重量计算。

1.2.3 培养时间对春石斛类原球茎克隆的影响

将春石斛类原球茎接种于液体培养基1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+6BA 0.5 mg·L-1，添加活性炭振荡培养。一共接种10瓶，每一瓶约接种2.0 g类原球茎，分别培养10、20、30 d后统计类原球茎重量，以类原球茎重量增加数/接种类原球茎重量计算。

1.2.4 培养基pH值对春石斛类原球茎克隆的影响

培养基灭菌前，pH值分别设为5.0、5.5、6.0、6.5，添加活性炭液体振荡培养，每个处理10瓶，每瓶约2.0 g原球茎，14 d后统计类原球茎重量，计算克隆系数，以接种类原球茎重量增加数/接种类原球茎重量。

各处理均采用不添加琼脂的1/2 MS培养基(激素组合和培养方式处理除外)，添加6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 1.0mg·L-1(激素处理除外)、3%的蔗糖、1.0 g·L-1活性炭(不同培养方式处理除外)。培养基pH调至5.5～6.0(pH值对照组除外)，各处理培养温度设为(25±2)℃，光照时间14 h/d，光照强度40 μmol·s-1。采取Microsoft Excel和SPSS软件进行数据统计与分析，多重对照用Duncan检验法。

2 结果与分析

2.1 激素组合对春石斛类原球茎克隆诱导的影响

激素配比对春石斛类原球茎克隆增殖的效果影响显著。表1表明，3号处理的春石斛类原球茎克隆系数最高，1号处理次之，22号最低。其中，6-BA比KT的克隆效果好；当KT浓度大于0.1 mg·L-1时，春石斛类原球茎克隆系数明显下降。当6-BA为0.5 mg·L-1时，NAA浓度控制在0～1.0 mg·L-1范围内效果较好。类原球茎经20 d培养后，表面出现新的不规则状凸起，进而发育形成新的类原球茎，实现了克隆增殖的目标。而原来的类原球茎则形成春石斛新个体。类原球茎克隆时切割不易过碎，不然会导致褐化坏死。另外，在培养基中添加适量活性炭对防止褐化有一定效果。

表1 不同激素组合对春石斛类原球茎克隆的影响

注：不同字母代表在0.05水平差异显著。以下各表同。

2.2 培养方式对春石斛类原球茎克隆的影响

2.2.1 液体、半固体、固体培养对春石斛类原球茎克隆的影响

由表2可知，春石斛类原球茎采用液体、半固体、固体等方式进行培养，其克隆效果差异显著。在不添加任何琼脂的4种激素组合的培养基中，诱导形成类原球茎的时间均较短，形成的类原球茎数量多，类原球茎克隆系数大，最大可达4.21；培养基较硬的固体培养最差，克隆系数只有2.27，且质地硬，表面发绿；而介于液体与固体之间的半固体培养次之，但增殖状况明显比液体培养差。在液体培养的4种激素组合中，春石斛类原球茎克隆效果差异不显著，但半固体诱导的类原球茎发育不够健壮，颜色呈淡黄绿，有玻璃化现象，类原球茎质地也较硬。因此，在春石斛类原球茎克隆增殖过程中，采取液相和固相结合的方式进行培养较好，即先把外植体接种于不添加琼脂的培养基中培养一段时间后，再转接到添加琼脂的培养基接着培养，诱导形成的类原球茎质量好，且培养周期短。

表2 液体、半固体、固体培养对春石斛类原球茎克隆的影响

2.2.2 液体静置、液体振荡培养对春石斛类原球茎克隆的影响

液体静置培养与振荡培养对春石斛类原球茎克隆的影响如表3所示。液体振荡培养的增殖系数为1.82，数量多，晶莹饱满；而液体静置培养只有0.73，且形成的类原球茎数量少，个小干瘪，故液体振荡培养比液体静置培养明显要好。添加活性炭可以吸附原球茎表面的褐化物质，一定程度上可增加原球茎数量，同时改变原球茎的质地，使原球茎更硬、更绿。

表3 液体静置、振荡培养

2.3 培养时间对春石斛类原球茎克隆的影响

培养时间对春石斛克隆的影响见表4。由表4可知，春石斛类原球茎克隆系数与液体培养时间成一定的线性相关。经过20 d培养后，春石斛类原球茎数量不断增加，原球茎色泽呈黄绿，有少数原球茎褐化，晶莹饱满；但培养30 d后，春石斛类原球茎色泽泛黄，褐化程度越来越严重。因此，春石斛培养的时间不易太长，培养20 d较好，不仅能保证形成一定数量的类原球茎，还能避免褐化现象。

2.4 pH值对春石斛类原球茎克隆增殖的影响

pH值对春石斛类原球茎克隆的影响如表5所示。由表5可知，采取液体振荡培养，pH值调节至5.5时，克隆增殖效果最佳，数量多，个体体积大；其次是pH值为6.0时，春石斛原球茎克隆数量多，但个体体积小；当pH值设为5.0时，效果最差，增殖系数只有1.31，产生的原球茎数量少，且个体体积小。

表4 培养时间对春石斛类原球茎克隆的影响

表5 pH值对春石斛类原球茎增殖的影响

3 结论与讨论

石斛兰组织培养技术早在20世纪60年代初国外就有不少研究[7-8]，并取得了一定的成效，不少品种还建立了快速繁殖体系。国内学界对春石斛的研究起步较晚，目前花卉市场上的春石斛大多数是引进日本等国的二、三代种苗[9-10]，经部分生产者通过多年的引种试种经验，选育出了一些适合我国栽培的优良品种，石斛兰正作为一种产业在迅速发展。

不同品种的春石斛，其克隆增殖最适基本培养基不同，虽然1/2 MS、MS、M及VW等均可用于原球茎克隆增殖，但不同培养基增殖速度不同、品质差异很大，大多数研究选用MS作为基本培养基[11-12]，本试验采用1/2 MS作为基本培养基，克隆效果较好。培养过程中，在添加不同的植物生长激素并改变激素浓度的情况下，春石斛类原球茎克隆增殖效果差异显著。其中，采用NAA 1.00 mg·L-1+6-BA 0.50 mg·L-1组合，春石斛类原球茎克隆增殖效果最佳；KT没有6-BA效果好；KT浓度大于0.1 mg·L-1，春石斛克隆增殖系数显著下降；当6-BA 0.5 mg·L-1，NAA浓度控制在0～1.00 mg·L-1范围内，效果较好。液体振荡明显比固体、半固体培养克隆增殖系数大，可能是因为液体培养基比固体培养基和半固体培养基通气性好，而且液体振荡培养时，类原球茎与培养基接触面大，吸收营养成分充足[13]。春石斛类原球茎克隆增殖系数与培养时间成一定的线性相关，经过20 d培养后，原球茎数量不断增大，褐化也变得严重，因此，诱导克隆培养时间不能太长，20 d即可，既能产生一定数量的原球茎新个体，又可克服褐化、污染等现象。同时，原球茎培养可以采用固相与液相相结合的培养方式培养[14-15]，即原球茎诱导在固体培养基上培养，而原球茎增殖采用液体振荡培养，这种培养方法不仅能保证原球茎的重量，而且能保证原球茎增殖的速度。不同的pH值对春石斛克隆增殖的影响也不同，采用液体振荡培养，pH值调节至5.5时，克隆增殖效果最佳，数量多，个体体积大。

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