猪瘟病毒RT-LAMP-LFD检测方法的建立与应用

朱俊灵, 叶佐东， 邓洁汝， 勾红潮， 陈金顶

(华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642)



猪瘟病毒RT-LAMP-LFD检测方法的建立与应用

朱俊灵†, 叶佐东†， 邓洁汝， 勾红潮， 陈金顶

(华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642)

摘要：【目的】建立一种新型的、能在基层场地进行实时便捷诊断的猪瘟病毒检测方法。【方法】环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)-横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick, LFD)相结合，针对猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)NS5B基因设计一套特异性引物及生物素标记探针，结合异硫氰酸荧光素标记的扩增产物，建立RT-LAMP-LFD检测方法。【结果】所建立的方法能够特异地检测出CSFV的存在，检测PRRSV、JEV、PCV-2等其他病毒均为阴性；所建立的CSFV-RT-LAMP 方法对RNA的最低检测限为50 pg；反应快速，整个扩增反应可在1 h 内完成；操作简单, 不需要PCR 仪等复杂的仪器，结果可经肉眼观察。【结论】应用RT-LAMP-LFD 检测CSFV特异性强、灵敏度高，并且操作安全、简便、快捷，可以满足基层检疫的需要。

关键词：猪瘟病毒；NS5B基因； 环介导等温扩增技术； 横向流动试纸条技术； 病毒检测

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的猪的一种高度接触性、急性传染病。该病的高发病率和高死亡率给养猪业造成巨大的经济损失，严重危害畜牧业的发展[1-2]。目前对CSFV的实验室诊断方法主要包括细胞培养分离病毒、实时RT-PCR等病原学方法，以及酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)和中和试验(NT)等血清学方法[3-6]。病毒分离通常是确诊疫病的经典方法，但由于CSFV 不同毒株的毒力差异很大，CSFV 感染猪的临床症状和病理变化差别很大, 一般很难根据临床表现和病理变化来确诊；实时荧光RT-PCR的方法快速、灵敏，但对于设施设备等试验条件的要求较高；而ELISA、IFA、NT等血清学方法在操作简便性、检测敏感性和特异性方面存在不足[7-8]。因此，建立一种快速、简便、灵敏度较高的检测猪瘟病毒的方法十分有意义。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是在基因的6个区域设计4种特异引物，然后在恒温条件下特异扩增目的DNA 的技术。与其他检测方法相比，该技术特异性强、灵敏度高、操作简便，无特殊设备要求，适用于基层及现场诊断使用[9]。横向流动试纸条(Lateral flow dipstick，LFD)法是利用含有生物素 (Biotin) 标记的LAMP扩增产物能与异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC) 标记的探针特异性杂交, 从而与胶体金标记的抗FITC的抗体结合形成三元复合物，结合在含生物素抗体的检测线上，而未杂交的FITC标记探针形成不含生物素的两元复合物，结合在含抗FITC的质控线上[10]。近年来，LAMP-LFD检测方法已经成功用于许多动物病毒性病原的检测。其优势在于不仅快速、特异、操作简单，而且避免了琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色肉眼观察所引起的假阳性。

本研究针对CSFVNS5B基因的保守区域序列设计LAMP引物。建立了猪瘟病毒RT-LAMP方法，然后结合LFD技术，建立了一种猪瘟病毒RT-LAMP-LFD检测方法，该方法简单、快速、灵敏度高，为基层养殖场和兽医站提供了CSFV初步筛选检测的理想方法。

1材料与方法

1.1病毒

猪瘟病毒GXW-07株、石门株，日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)SA14-14-2株，猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)GD08-2株，胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)均由华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学教研室保藏；猪圆环病毒2型(Porcine circovirus-2，PCV-2)LG株油乳剂灭活疫苗购自上海海利生物科技有限公司；伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)Bartha-K61株灭活疫苗购自哈尔滨维科生物科技有限公司。

1.2主要试剂

dNTP、AMV 反转录酶、DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒、RRI、Ex-TaqDNA聚合酶和琼脂糖为TaKaRa公司产品；BstDNA聚合酶为New England公司产品；硫酸镁、甜菜碱(Betaine)、氯化锰、钙黄绿素(Calcein)为美国Sigma公司产品；RT-LAMP引物由华南农业大学微生物教研室设计，由上海生工生物工程有限公司合成；核酸试纸条密闭反应装置(LFD)为中国杭州优思达公司产品。

1.3主要仪器

高压灭菌锅为日本Sanyo MLS-320产品。纯水仪为瑞士ELAG电子有限公司产品。台式冷冻高速离心机为美国Thermo公司产品。小型高速离心机为德国Eppendorf公司产品。LX-100手掌型离心机为江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品。凝胶图像分析系统为MOLECULAR IMAGING公司产品。ABI 9700PCR扩增仪为美国ABI公司产品。DK-8D型电热恒温水槽为上海森信实验仪器有限公司产品。BIO-RAD电泳仪为Powerpac Basic公司产品。

1.4病毒核酸提取

根据MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5.0说明书进行DNA/RNA抽提。

1.5引物和荧光探针的设计合成

运用Primer Primier5.0软件，针对CSFVNS5B基因的保守序列设计1对PCR引物P1和P2(表1)。根据LAMP引物设计原则，应用在线引物设计软件Primer Exporer 4.0针对CSFVNS5B基因的保守区域序列(GenBank No. EU915211.1)，进行LAMP引物设计。引物包括1对外引物(F3和B3)、1对内引物(FIP和BIP)、1条环引物(LB)以及1条探针(Probe)(表1)，所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成并标记(图1)。

1.6环介导等温扩增技术扩增条件的优化

1.6.1CSFV RT-LAMP-LFD检测方法的建立以猪瘟病毒GXW-07株基因组RNA为模板，25 μL反应体系包含:10×Thermopol Buffer 2.5 μL、dNTP(2.5 mmol·L-1)4.0 μL、甜菜碱(10 mol·L-1)2.5 μL、FIP(10 μmol·L-1)+BIP(10 μmol·L-1)4.0 μL、LF(10 μmol·L-1)+LB(10 μmol·L-1)2.0 μL、F3(10 μmol·L-1)+B3(10 μmol·L-1)0.5 μL、Probe(10 μmol·L-1)2.0 μL、硫酸镁(100 mmol·L-1)0.5 μL、BstDNA polymerase(8 U·μL-1)1.0 μL、AMV反转录酶(5 U·μL-1) 0.5 μL、模板RNA 5 μL，加DEPC水至25 μL。阴性对照不加模板。每个反应至少重复3次，用20 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

表1　CSFV RT-LAMP-LFD 引物序列

图1　CSFV RT-LAMP-LFD引物设计示意图

1.6.2CSFV RT-LAMP反应条件优化分别在59、60、61、62、63、64、65、66 ℃ 8个温度梯度进行RT-LAMP反应，根据扩增效果确定最佳反应条件。分别设计10、20、30、40、50、60、70 min 7个时间梯度, 在已优化得到的最佳反应温度下进行RT-LAMP反应，根据扩增效果确定最佳反应条件。

1.6.3CSFV RT-LAMP反应体系优化分别按2、4、6、8、10 mmol·L-15个Mg2+浓度梯度进行RT-LAMP反应, 其余成分不变，根据扩增效果得出CSFV RT-LAMP反应的最佳Mg2+浓度。分别按0、0.5、1.0、1.5、2.0 mol·L-15个甜菜碱浓度梯度进行RT-LAMP反应，以优化的条件和成分，根据扩增效果得出CSFV RT-LAMP反应的最佳甜菜碱浓度。分别按0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol·L-16个dNTP浓度梯度进行RT-LAMP反应，以优化的条件和成分，根据扩增效果得出CSFV RT-LAMP反应的最佳dNTP浓度。分别按4、8、12、16、20 U 5个BstDNA聚合酶浓度梯度进行RT-LAMP反应，以优化的条件和成分，根据扩增效果得出CSFV RT-LAMP反应的最佳BstDNA聚合酶浓度。分别按1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 U 5个AMV反转录酶浓度梯度进行RT-LAMP反应，以优化的条件和成分，根据扩增效果得出CSFV RT-LAMP反应的最佳AMV反转录酶浓度。以外引物的用量为参照，设计外引物与环引物的比例分别为1∶0、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8共6个梯度，以优化的条件和成分，根据扩增效果得出CSFV RT-LAMP反应的最佳环引物浓度。

1.7CSFV RT-LAMP-LFD方法的特异性分析

PRRSV GD08-2株、JEV SA14-14-2株基因组RNA，PCV-2、PRV、APP的基因组DNA为模板作为特异性对照，按优化的条件，检测该方法的特异性，同时以CSFV GXW-07株、CSFV石门株为阳性对照，每个反应至少重复3次。其中5 μL反应产物用于20 g·L-1琼脂糖凝胶电泳进行检测，剩余20 μL产物用于LFD检测。

1.8CSFV RT-LAMP-LFD方法的灵敏度分析

抽提CSFV GXW-07株的RNA模板并制备出CSFV标准品(10 ng·μL-1)作为初始模板，将初始模板进行10倍梯度稀释(10-1～10-7)，按优化的条件进行反应。反应产物分别用LFD、钙黄绿素-可视化RT-LAMP、20 g·L-1琼脂糖凝胶电泳进行检测。每个试验至少重复3次。

1.9CSFV RT-PCR方法

参照试剂盒说明书进行RNA抽提，逆转录的反应体系20 μL：5×AMV Buffer 4 μL、dNTP (10 mmol·L-1)2 μL、RNase inhibitor (40 U) 0.5 μL、Random primer (50 pmol)1 μL、AMV(5 U)1 μL、RNA10 μL，补DEPC水至20 μL。42 ℃反应1 h。获得的cDNA作模板，P1、P2作为上、下游引物进行PCR。PCR反应体系25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTPs (2.5 mmol)2 μL、P1 (10 μmol)和P2(10 μmol)各0.5 μL、Ex-Taq(5 U) 0.25 μL、模板2 μL，加双蒸水至25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃终延伸10 min。

2结果

2.1CSFV RT-LAMP-LFD检测方法的建立

以猪瘟病毒GXW-07株RNA为模板进行RT-LAMP反应，反应后的产物分别用20 g·L-1凝胶电泳、钙黄绿素法以及LFD进行检测，验证检测方法的可行性。琼脂糖凝胶电泳结果显示CSFV阳性模板有梯状条带而空白对照无条带(图2A)；钙黄绿素法的结果显示CSFV阳性模板结果出现荧光绿色而空白对照为橘黄色(图2B)；RT-LAMP-LFD结果显示，CSFV阳性模板出现2条红色条带，分别位于检测区(T)内和质量控制区(C)内，而空白对照组仅在质量控制区(C)出现1条红色条带(图2C)。结果表明，该CSFV RT-LAMP-LFD检测方法可行。

M：2 000 bp DNA marker；1、4、6：空白对照；2、3、5：CSFV阳性模板。

2.2CSFV RT-LAMP扩增条件的确立

在反应条件优化试验中，在59～66 ℃ 8个不同温度间进行RT-LAMP反应，结果(图3A)显示泳道2扩增条带最亮，因此选择60 ℃为CSFV RT-LAMP反应的最佳反应温度；反应时间优化结果(图3B)显示, 从30 min时开始即可以通过琼脂糖凝胶电泳检测到RT-LAMP扩增产物，反应50 min后产物量趋于饱和，因此选定50 min 为CSFV RT-LAMP反应的最佳反应时间。反应体系优化结果如图4，CSFV RT-LAMP最佳反应体系为：3 mmol·L-1的镁离子(图4A)， 1.5 mol·L-1甜菜碱(图4B)，0.5 mmol·L-1的dNTP(图4C)，8 U的BstDNA聚合酶(图4D)和2.5 U的AMV的逆转录酶(图4E)，外引物与环引物用量比为1∶4(图4F)。

M：2 000 bp DNA marker；A：反应温度优化试验，1～8分别为：59～66 ℃；B：反应时间优化试验，1～7分别为：10～70 min。

图3CSFV RT-LAMP反应条件优化

Fig.3Optimization of reaction conditions of CSFV RT-LAMP

M:2 000 bp DNA marker；A：硫酸镁浓度优化试验，1～5分别为：0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mmol·L-1硫酸镁；B：甜菜碱浓度优化试验，1～5分别为：0、0.5、1.0、1.5、2.0 mol·L-1甜菜碱；C：dNTP浓度优化试验， 1～6分别为：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol·L-1dNTP；D：BstDNA聚合酶浓度优化试验，1～5分别为：4、8、12、16、20 UBstDNA聚合酶；E：AMV逆转录酶浓度优化试验，1～5分别为：1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 U AMV逆转录酶；F：外引物与环引物的用量比例优化试验，1～6示外引物与环引物用量比分别为：1∶0、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8。

图4CSFV RT-LAMP反应体系优化

Fig.4Optimization of reaction components of CSFV RT-LAMP

2.3CSFV RT-LAMP-LFD检测方法特异性分析

为了确认CSFV RT-LAMP-LFD检测方法的特异性，用优化的条件，分别以PRRSV、JEV、PCV-2、PRV、APP、CSFV GXW-07株和CSFV石门株的核酸模板进行RT-LAMP方法检测，并用琼脂糖凝胶电泳法作为方法对照。结果表明，CSFV GXW-07株和石门株为阳性，其余病原均为阴性(图5)，该结果表明所建立的CSFV RT-LAMP-LFD检测方法具有良好的特异性。

M：2 000 bp DNA marker； 1～7分别为：CSFV GWX-07株、CSFV石门株、APP、 PCV-2、 PRV、 JEV、 PRRSV;A：RT-LAMP琼脂糖凝胶电泳检测；B：RT-LAMP-LFD方法检测。

图5CSFV RT-LAMP-LFD检测方法特异性分析

Fig.5The specificity of CSFV RT-LAMP-LFD detection method

2.4CSFV RT-LAMP-LFD检测方法的灵敏度分析

对CSFV GXW-07株基因组RNA进行10倍梯度稀释试验表明，钙黄绿素-可视化RT-LAMP方法(图6A)、RT-LAMP琼脂糖凝胶电泳检测方法(图6B)以及RT-LAMP-LFD检测方法(图6C)的敏感性一致，最低检测模板浓度均为50 pg，但比RT-PCR检测(500 pg)方法(图6D)的灵敏度高10倍。

1：5 ng；2：500 pg；3：50 pg；4：5 pg；5：500 fg；6：50 fg；7：5 fg；M1：2 000 bp DNA marker；M2：1 000 bp DNA marker;A：钙黄绿素-可视化RT-LAMP自然光条件下灵敏度试验；B：RT-LAMP琼脂糖凝胶电泳方法的灵敏度试验;C：RT-LAMP-LFD检测方法的灵敏度试验；D：RT-PCR方法的灵敏度试验。

图6CSFV RT-LAMP-LFD检测方法灵敏度分析

Fig.6The sensitivity of CSFV RT-LAMP-LFD detection method

2.5CSFV RT-LAMP-LFD检测方法的临床应用研究

将临床采集的43份疑似CSFV感染的病料进行RT-PCR和RT-LAMP-LFD方法检测。结果(表2)显示，应用RT-PCR方法检测时，29份呈阳性，阳性率为67.4%；应用RT-LAMP-LFD方法检测时，31份呈阳性，阳性率为72.1%，二者的符合率为93.5%。CSFV RT-LAMP-LFD检测方法的临床检出率更高。

表2　CSFV RT-LAMP-LFD检测方法的临床应用

3讨论

猪瘟是猪重大烈性传染病之一，在中国主要采用猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)接种的方法预防和控制CSF的流行，但是近年来，CSF在我国重新抬头，出现非典型、持续感染、免疫抑制的流行特征，传统疫苗的作用越来越小[11-12]。传统的诊断方法如PCR、IFA等虽然精确，但却受制于设备的需求以及检测耗时较长的原因而不能在基层广泛应用。因此，建立一种新型、快速、简便的猪瘟检测方法对基层猪瘟预防和诊断具有重大意义。

本研究采用RT-LAMP和横向流动试纸条(LFD)技术相结合的方法，建立一种CSFV RT-LAMP-LFD检测方法，该法只需在水浴锅中恒温60 ℃反应50 min，然后通过标记的探针在密闭的横向流动试纸条杂交，5 min后用肉眼就可观察到检测结果。整个过程可在1 h之内完成，且无需特殊设备要求。目前CSFV国标的检测方法是间接免疫荧光方法，该方法是基于检测CSFV表面抗原蛋白进行的。在实际应用中，间接免疫荧光方法存在耗时较长，操作复杂等弊端，比较难以具体开展。而本研究所建立的CSFV RT-LAMP-LFD检测方法是基于病毒核酸检测，因此我们选择与行业中常用的而又较易开展的核酸检测方法RT-PCR方法进行平行比较。旨在通过比较其对病毒核酸方面的检测时间、可操作性及临床应用效果，探索一种可在基层场地对临床病料进行实时便捷分析的检测方法。与传统CSF诊断方法相比，本试验建立的方法并不需要特殊设备要求，与RT-PCR相比，检测时间大大缩短，灵敏度高了10倍，跟钙黄绿素-可视化RT-LAMP方法相比，消除了因为肉眼观察颜色导致人为误差，而且试纸条是在密闭容器里完成，因此也没有其他因外加荧光染料导致的RT-LAMP产物的污染产生的误差，避免了假阳性产生。因此对于基础临床病料诊断具有良好的应用前景。

由于该方法是针对CSFVNS5B基因设计的引物，而CSF强弱毒株基因组NS5B序列上没有太大的区别，所以本研究所建立方法不能用于区分CSFV强弱毒株，对于该方法在强弱毒株的鉴别方面的不足，我们需对强弱毒株的基因组进行进一步分析，并探索可用于RT-LAMP-LFD检查方法的新引物。

RT-LAMP引物的设计是整个检测方法的关键，好的引物能够保证检测结果的准确性。本试验首先对设计的针对CSFVNS5B基因的 RT-LAMP引物进行筛选，结果表明，所设计的针对CSFVNS5B基因的特异性引物具有良好的特异性，并不与其他病原产生阳性反应。有研究表明，RT-LAMP的反应条件和体系也直接影响了检测的特异性和敏感度，如内外引物的浓度、Mg2+浓度以及酶浓度等[9, 13]。因此本试验对建立的CSFV RT-LAMP检测方法进行体系和条件的优化。本试验设计的1对环引物大大加快了扩增反应的进行。有趣的是，过量的dNTPs和Bst酶会导致反应产物浓度降低。由此可见，体系成分和条件的优化对增加检测方法的灵敏度和特异性很有必要。另外在临床病料检测试验过程中，发现CSFV RT-LAMP-LFD检测方法比RT-PCR的临床检出率更高。

我们将RT-LAMP技术与LFD技术相结合应用于对CSFV的检测，该方法可用于检测CSFV感染的组织或血清等临床样品。本试验所建立的CSFV RT-LAMP-LFD检测方法旨在探索一种可在基层场地对正常与疑似CSFV感染猪进行实时便捷诊断的检测方法，其应用价值主要在于CSFV猪瘟病毒感染猪的初步诊断、进出口贸易中CSF的快速筛查以及无CSF疫苗免疫猪场的CSF净化。这对于开发CSFV感染的新型诊断工具，具有良好的应用前景。

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【责任编辑柴焰】

Rapid detection of classical swine fever virus by loop-mediatedisothermal

amplification combined with lateral flow dipstick method

ZHU Junling†, YE Zuodong†, DENG Jieru, GOU Hongchao, CHEN Jinding

(College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Abstract：【Objective】 The experiment was conducted to establish a rapid real time detection method of classical swine fever virus at local fields. 【Method】 A rapid detection method(RT-LAMP-LFD) of classical swine fever virus(CSFV) was developed by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) combined with lateral flow dipstick (LFD) method. The LAMP method for amplification of the CSFVNS5Bgene using fluorescein isothiocyanate-labeled primer was combined with a chromatographic LFD for rapid and simple visual detection of CSFV. 【Result】 This method could specifically detect CSFV, but not other virus such as PRRSV, JEV and PCV-2. The minimum detection limit of the CSFV-RT-LAMP-LFD method was 50 pg. The detection could be finished within 1 h without using complex instruments such as PCR machine and the results were visible by eye. 【Conclusion】 This RT-LAMP-LFD method is a highly specific and sensitive, safe, rapid and simple way for field detection of CSFV infection.

Key words：classical swine fever virus；NS5Bgene； LAMP； LFD； virus detection

中图分类号：S855.3

文献标志码：A

文章编号：1001-411X(2016)01-0001-07

基金项目：国家自然科学基金(U1405216, 31172321和31472200)；广东省高等教育科技创新特殊项目(2012CXZD0013)

作者简介：朱俊灵(1989—)，男，硕士研究生，E-mail: 919736608@qq.com; 叶佐东(1990—)，男，硕士研究生，E-mail: zuodongye@126.com；†对本文贡献相同；通信作者：陈金顶(1968—)，男，教授，博士，E-mail: jdchen@scau.edu.cn

收稿日期：2015-04-13优先出版时间：2015-12-07

优先出版网址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20151207.1115.002.html

朱俊灵， 叶佐东， 邓洁汝，等.猪瘟病毒RT-LAMP-LFD检测方法的建立与应用[J].华南农业大学学报，2016,37(1):1-7.