胶体金法和平板及试管凝集检测羊布鲁氏菌病的比较

何彦春，李克生，贺奋义，杜慧芬 ，钱振波，许菲菲

(1.张掖市动物疫病预防控制中心，甘肃 张掖 734000；2.兰州雅华生物技术有限公司；3.甘肃省动物疫病预防控制中心)



胶体金法和平板及试管凝集检测羊布鲁氏菌病的比较

何彦春1，李克生2，贺奋义3，*，杜慧芬2，钱振波1，许菲菲2

(1.张掖市动物疫病预防控制中心，甘肃 张掖 734000；2.兰州雅华生物技术有限公司；3.甘肃省动物疫病预防控制中心)

为了验证免疫胶体金法(ICG)在羊布鲁氏菌病检测中的应用效果，选择经虎红平板凝集试验(RBPT)检测出的羊阳性和阴性血清各15份、经试管凝集试验(SAT)确定的阳性羊现场采集的耳尖全血15份，用胶体金法进行复检。结果表明，平板凝集检出的15份阳性血清用胶体金法检出阳性13份，符合率86.7%；平板凝集检出的15份阴性血清用胶体金法检出阴性15份，符合率100%；试管凝集检出的15份阳性样品，现场采集耳尖血用胶体金法检出阳性15份，符合率100%。初步表明胶体金法具有操作简便、快速、微量等特点, 适合于羊布鲁氏菌病的现场检测。

免疫胶体金法；平板凝集试验；试管凝集试验；羊布鲁氏杆菌病

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种以流产和发热为特征的人畜共患的细菌性传染病。布鲁氏菌具有高度传染性，我国将其列为二类动物疫病。世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病。该病属自然疫源性传染病，在世界各地分布广泛，严重威胁着人和多种动物的生命健康。近年来，我国各地动物布病疫情反弹非常明显，动物布病检测数量越来越大。动物布病的实验室检测主要采用虎红平板凝集试验(RBPT)和试管凝集试验(SAT)2种免疫学方法。这种免疫学方法在布病监测中起到了重要的作用，由于这2种免疫学方法均存在抗原、血清用量大, 操作步骤复杂等缺点, 且(SAT)检测时间较长，24 h后才能出结果，不能实现现场检测。理想的检测方法应具有简便、快速、微量、敏感、特异、试剂稳定等优点。兰州雅华生物技术有限公司研制生产的用作布病检测的免疫胶体金技术(ICG)具有良好敏感性、特异性和稳定性。为了验证胶体金(ICG)法和虎红平板凝集试验、试管凝集试验在动物布病检测中的符合情况，张掖市动物疫病预防控制中心联合兰州雅华公司开展了本试验。

1　材料与方法

1.1被检样品

2015年11月份采自甘肃省肃南县康乐乡青台子村张某某的羊群。张某某饲养绵羊207只，经虎红平板凝集试验检测，检出阳性67只，后经试管凝集试验最终确定阳性64只，阳性率 30.9%。试验用的阳性血清、阴性血清、阳性羊的全血，均采此该羊群。

1.2检测试剂

布氏杆菌虎红平板凝集试验抗原、阳性血清、阴性血清，中国兽医药品监察所生产，批号：201501；布氏杆菌病试管抗原、阳性血清、阴性血清，哈药集团生物疫苗有限公司生产，批号：201502；羊布病抗体IgG检测试剂盒(胶体金法)，兰州雅华生物技术有限公司生产，批号：20150601。

1.3试验方法

1.3.1虎红平板凝集试验(RBPT)按照动物布鲁氏菌病诊断技术(GB/ T 18646-2002)规定的方法进行检测。在玻片上加0.03 mL被检血清，然后加入虎红平板抗原0.03mL，摇匀或用牙签混匀，在4 min内判定结果。

1.3.2试管凝集试验(SAT)按照动物布鲁氏菌病诊断技术(GB/ T 18646-2002)规定的方法进行操作，血清凝集滴度(价)在在1∶50以上为阳性，1∶25为可疑。

1.3.3免疫胶体金法(ICG)①虎红平板凝集试验阳性和阴性血清用胶体金法复检。随机选择15份虎红平板凝集试验检出的羊阳性血清和阴性血清各15份用作被检血清。羊布病抗体IgG检测试剂盒从冰箱取出恢复至室温，试剂盒撕开铝膜袋取出测试板平放，在检测板加样孔中加10 μL被检血清，然后加入100 μL(2滴)样品稀释液。3～5 min内观察检测卡中部检视窗的结果，10 min内结果有效。若样品中存在布氏杆菌抗体IgG，则布氏杆菌抗体IgG与样品吸附垫中的胶体金-抗羊IgG单抗结合物形成复合物，复合物沿硝酸纤维素膜移动到检测区，与检测线上包被的布氏杆菌特异性抗原结合，多余的未被结合的结合物继续移动到质控区，与质控线上包被的羊抗鼠IgG抗体结合，反应膜上出现1条红色的检测线和1条红色的质控线。即阳性样品在观察窗T、C处各出现一条红色线。若样本中不存在布鲁氏杆菌IgG抗体，则反应膜只出现一条控制线。即阴性样品仅在观察窗C处出现一条红色线，T区不出现显色线；②试管凝集试验阳性羊现场采集全血用胶体金法复检:随机选择15份试管凝集试验阳性样品，根据样品编号在羊群里找见对应的羊只，现场采集耳尖血，现场检测。除被检样品为耳尖鲜血10 μL外，其余过程同①。

2　结果与分析

检测结果表明，虎红平板凝集试验检出的15份阳性样品，用胶体金法检出阳性13份，符合率86.7%；虎红平板试验检出的15份阴性样品，用胶体金法检出阴性15份，符合率100%；试管凝集试验检出的15份阳性样品，现场采集耳尖血用胶体金法检出阳性15份，符合率100%。

3　讨论

本次试验表明，用胶体金法检测羊血清样品和平板凝集试验的结果相近，用胶体金法检测羊全血样品和试管凝集试验的结果相同。但胶体金法可以实现现场检测，可以弥补平板凝集和试管凝集不能开展现场检测的缺陷。由于本次对比试验采用的样本数较少，大群体使用效果有待近一步验证。如果胶体金法经改进后进一步提高准确性和稳定性，进一步提高反应速度，进一步降低成本，并能作为国家检测标准通过审定发布，将会大大减轻布病检测净化工作强度，将为羊布病检测净化工作开创新局面。

面对布病反弹趋势，广大兽医工作者承担的检疫净化任务非常繁重，迫切需要快速、简便，能够现场检疫、现场出结果的检测方法。虎红平板凝集试验(RBPT)操作简易、检测快速，成本低廉，但必须用血清作为被检样品，且准确性易受温度和凝集时间的影响，抗原的标准化也可影响其敏感性。试管凝集试验(SAT)可以定量，因而在判定反应强度上比虎红平板凝集试验更精确。1998年，我国将其列入国标作为诊断布病的正式法定试验并沿用至今。该实验操作步骤繁琐，需37 ℃条件下孵育过夜，较费时，不适于现场检疫和基层采用。免疫胶体金技术(ICG)是一种常见的标记技术 , 它是以胶体金为标记物 , 示踪特异性抗原抗体反应的标记技术。它是继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶 ) 后发展起来的固相标记免疫测定技术。免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法,因其快速简便、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点已在兽医临床上的得到广泛应用。

Comparison of Detecting Sheep Brucellosis among Immune Colloidal Gold Method, Rose Bengal Precipitation Test and Serum Agglutination Test

HE Yan-chun1, LI Ke-sheng2, HE Fen-yi3,*, DU Hui-fen2, QIAN Zhen-bo1, XU Fei-fei2

(1.ZhangyeAnimalDiseasePreventionandControlCenter,ZhangyeGansu734000China; 2.LanzhouYahuaBiologicalTechnologyCo.,Ltd;. 3.AnimalDiseasePreventionandControlCenterinGansuProvince)

In order to confirm the application result of immune colloidal gold method (ICG) on sheep brucellosis, and this study selected the rose bengal precipitation test (RBPT) to detect the 15 sets of positive and negative serum of sheep. The serum agglutination test (SAT) was used to determine 15 sets of positive ear blood of sheep, then the re-inspection was implemented using colloidal gold method. The results showed that positive serum detection by RBPT obtained 15 sets and 13 sets by SAT, and coincidence rate was 86.7 %; the negative serum detection by RBPT and SAT obtained the same 15 sets, and coincidence rate was 100 %. Samples of 15 sets of positive serum were detected by SAT, which was same as colloidal gold method, and coincidence rate was 100 %. This study preliminarily showed that colloidal gold method has the characteristics of simple, rapid operation, quick, trace and so on. Therefore, the colloidal gold method is suitable for the spot detection of sheep brucellosis.

Immune colloidal gold method; rose bengal precipitation test; serum agglutination test; sheep brucellosis

2016-03-24

甘肃省科技重大专项(1203NK1)A017。

何彦春(1966-),男,甘肃天水人,本科,农业推广研究员,主要从事动物疫病防控与研究工作。

贺奋义(1962-),男,甘肃山丹人,研究员,主要从事动物疫病预防控制的研究及应用工作。

S 852.5+3

C

1004-6704(2016)05-0100-02