牛呼吸道合胞体病毒流行病学的研究

马莉莉，倪宏波

牛呼吸道合胞体病毒流行病学的研究

马莉莉，倪宏波⋆

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319）

牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）是一种有包膜单股负链RNA病毒，属于副粘病毒科中肺病毒属病毒成员。自从20世纪70年代初BRSV被确认为是牛犊中引起呼吸道疾病的主要原因。众多免疫学和分子生物学方法的出现方便BRSV的研究。尽管如此，流行病学、分子流行病学和病毒的进化等许多方面仍然没有完全了解。自然感染过程的复杂使诊断更难，急需更好的治疗预防措施控制疾病。了解BRSV才能够建立感染机制，才能防止病毒和疾病的传播。本文综述了有关BRSV流行病学和分子流行病学的重要信息，并突出了病毒进化在病毒传播中的重要性。

牛呼吸道合胞病毒；全球分布；基因型；演化

1 简介

牛呼吸道合胞体病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）是主要在犊牛中引起一种急性呼吸道综合征的病原体，由于高的发病率、死亡率和治疗成本，导致BRSV感染生产损失和经济损失[1]。BRSV是一种有包膜、非分段、负链的RNA，副黏液病毒科，肺病毒亚科，肺病毒属成员。病毒体含有三种表面糖蛋白（糖蛋白[G]、融合蛋白[F]和小疏水蛋白[SH]）。包膜由核蛋白（N）、磷蛋白（P）组成的螺旋形核衣壳，病毒RNA依赖性聚合酶蛋白（L）的M蛋白和称作M2-1转录抗终止因子，基因组RNA（约15 000个核苷酸）也编码RNA调控蛋白M2-2和两个非结构蛋白，NS1和NS2[2]。

BRSV和人类呼吸道合胞病毒（HRSV）密切相关，两种病毒之间的流行病学有相似之处也有差异[3]。两种病毒之间的相似性为揭示BSRV可致病性提供便利的研究机制，近年来对于全球流行病学和BRSV分子流行病学了解已显著提高，研究BRSV流行病学和分子流行病学的各个方面，以及病毒进化之间的关系。

2 流行病学

BRSV感染在世界传播广泛，牛最易感染，绵羊也可被感染，传染率通常相当高，可以在畜群之间进行病毒传播。牛群之间局部扩散和空气传播对畜群间传播并不是非常重要，畜群的直接传输通常会导致感染新动物，而间接传输是由人群携带进行传播，BRSV通常在冬季暴发，血清感染的阳性率在不同区域良莠不齐[4]。发病率相当高，某些情况乳牛群中临床呼吸疾病高达60%。BRSV可以成为影响各年龄动物的流行病，接触病毒的畜群倾向于感染更年轻的动物和易感动物。种群内病毒的生存机制尚不完全清楚，可从无症状的动物中分离病毒并持续数月，也会持续感染相对孤立状态下的小牛[5]，可能由于发生潜伏感染造成的。据报道牛亚临床感染不保证BRSV的持久性，认为感染来源于临床带病动物，旨在评估病毒传播的持久性，以充分理解BRSV的传输机制。

在北美患病率很大，1970年初美国研究表明成年牛中67%的感染率，无症状牛血清阳性率高达95%[6]。血清阳性率似乎与宿主年龄密切相关，在老年动物中发病率较高，美国南部地区普遍表现出更高的血清阳性率相比于北部地区。而其他病毒，如牛病毒性腹泻和副流感病毒也提高了死亡率。在欧洲大陆传播情况下，从瑞典南部地区的样品中观察到牛奶样品中高的抗体频率，北部样品检测率较低，表明BRSV感染主要发生在瑞典中西部和南部地区。丹麦报道BRSV感染率（54%）相当高[7]，在比利时观察到BRSV感染的高流行性，在英格兰报道散装罐牛奶样品中存在抗体。在非洲，埃塞俄比亚和南非也证明有高发率的BRSV感染，高血清阳性率也与设施有关，有机农场相比于传统农场表现出较低抗体。因此，需要更多的信息来了解地理区域病毒存活的机制，此外对于牛群爆发的监测可以提供更有价值的信息，帮助了解BRSV感染的流行病学。

3 分子流行病学

有关BRSV感染的分子流行病学的资料有限，但DNA测序可能有助于揭开BRSV传输的分子机制，系统遗传学可以确定不同基因型BRSV的亲缘关系，同时了解BRSV的分子基础，以及用于研究BRSV起源和后续演进。最新序列信息有助于了解BRSV感染模式[8]，目前进化方法方便促进研究新毒株的起源，病毒重组的鉴定，群体大小的出现，病毒传播以及演变。分子流行病学方法提供关于BRSV演化的重要见解，病毒分子流行病学的研究很可能会提高病毒传播的动态。BRSV分离物中出现抗原的变异，针对特定病毒株的多克隆血清缺乏建议，没有认识到不同分离物之间的反应，此外也可以推断一些结构蛋白的分子大小，暗示BRSV是由不同的亚组组成。BRSV存在多样性，在开创性研究中，BRSV中表现出不同识别模式，表明抗原的多样性，虽然BRSV疫苗有很多功效，但疫苗的失败可能是归因于BRSV更广泛的抗原谱，报告也认为有两种不同BRSV亚组的存在。

BRSV的分子流行病学研究始于核苷酸糖蛋白（G）、融合蛋白（F）、核衣壳（N）、基质（M）、磷蛋白（P），20世纪90年代初疏水性（SH）和M2蛋白初步评价了两个菌株之间P蛋白的同源性，显示有97%同一性的核苷酸水平[9]。随后分析有限数量的核苷酸变异G蛋白的水平，表明BRSV菌株之间的同一性的水平介于84%和95%。这种程度的异质性表明只存在单一基因组。BRSV株之间抗原异质性和分子多样性之间的直接比较表明抗原性差异是亚组间变化的结果，在野生BRSV菌株也证实存在抗原变异。

通过单克隆抗体识别G蛋白部分核苷酸序列，对抗BRSV G、F、N和P蛋白表明分离株随机抗原的差异性。观察病毒蛋白存在表位交叉反应，特别是F蛋白。此外观察F蛋白和P蛋白结构上存在差异，P蛋白表现出多样性，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析时分子大小表现差异，与抗原相关的F、N蛋白没有观察到和P蛋白结构上的差异。G蛋白的核苷酸序列同一性介于94.1%～99.9%。相比较而言，预测的氨基酸序列同源性范围为89.9%～99.6%，认为BRSV属于一个单系群[10]。

更全面的研究分析针对BRSV G蛋白的反应模式，从不同地理区域分离的G蛋白基因段发现遗传多样性，表明BRSV株之间组内遗传变异88%～100%之间[11]。相应系统遗传分析表明存在两个主要分支，分支被进一步细分为两组，Ia和Ib，再分成五个不同谱系，每个代表一个集群，Ia族所含毒株属于抗原亚组A；而分支Ib包括欧洲血统属于亚组B；分支Ⅱ，分类为抗原亚组B；第三个集群包括斯堪的纳维亚株[11]。间接观察进化树和一些菌株之间的抗原模式关系认为BRSV属于单个抗原组，与研究组有不同的遗传变异体。瑞典和丹麦之间的比较分析表明，瑞典株的还原序列多样性可能是瑞典封闭栏中奶牛的有限进口造成的，这些发现认为母牛进口增加了区域BRSV谱系核苷酸序列的多样性。

一项大规模研究欧洲、北美BRSV的分子流行病学和进化，该研究评估了N、F和G蛋白的核苷酸多样性，并分析氨基酸序列以及它们的亲缘关系。百分比为G蛋白基因（8%），N和F蛋白的基因最低（2%）[12]。一般来说，在所有BRSV蛋白中观察到同区域内动物的同源性，其中N和G蛋白基因序列中检测到的基因序列的差异，表明单个病毒或密切相关的病毒会在给定时间内传染指定的畜群。在系统遗传分析基础上，G蛋白质序列分成六个不同的组，进行N和F蛋白基因序列的分析；观察到任一蛋白质只有五个聚类组。如预期的一样，BRSV序列的特征聚类是根据地理来源区别的，进一步观察确定地理和时间聚类的理论。在1976年前欧洲分离出亚群I，美国的病毒分离出亚组Ⅲ。从北欧、丹麦和瑞典株发现亚组Ⅱ呈簇状，荷兰、比利时和法国分别发现亚组Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ[13]。研究发现动物感染用BRSV疫苗的免疫接种失败，表明商业疫苗对抗感病毒染效果不佳，此外观察到BRSV的N、G和F蛋白的演变，可能与不同国家疫苗接种相关，在G蛋白、N和F蛋白的特定区域都有强的阳性反应等。法国BRSV分离株列入本研究还显示保守中央疏水部位于突变G蛋白胞外域[14]，形成四个Cys残基、两个二硫键、一个螺旋，这些对G蛋白的三维结构至关重要，高度保守区域不断修改免疫G蛋白，增加BRSV在疫苗发展上的重要性。总体来说现代分子流行病学为研究不同区域BRSV分子流行病学模式建立了基础。BRSV已被证明作为病毒复杂混合物变种的存在，称为不确定的“变异种”。在临床分离株BRSV G蛋白基因的分析中证明亚群的共存性，克隆分析G-编码区的核苷酸异质性表现出每个核苷酸突变频率范围是从6.8×104到10.1×104进行替换[15]，结果表明，BRSV种群进化的复杂和动态性，尽管这种病毒遗传有明显的稳定性。

在牛群间相同病毒的循环通过分子流行病学途径表现出来，特别是疾病暴发期间。然而病毒株复发性也会发生显著变化（高达11%），在牛群中不同BRSV的循环变异会持续感染小牛。由于病毒进化，新的高强度病毒成为主体传播给动物，高水平多样性的爆发可能表明BRSV是从外引进新病毒株的结果[16]。所有研究集中于基因编码G蛋白核苷酸序列的研究，通过G蛋白获得的信息已经用于了解BRSV的序列，区域所提供的序列信息用于表明病毒株。未来研究会分析更多BRSV部分，以及病毒基因组的全长，这些将有可能为该病毒株提供更准确的理解。BRSV全球分子流行病学研究一直难以实现，目前少量文献报告提供了BRSV的分布情况。分子BRSV的表征区域在世界仍然是相当不完整，日本在21世纪初进行一项关于亚群菌株循环的研究，该菌株被进一步细分为两个不同谱系[17]，但这项研究只有极少数菌株，并未全面了解该地区BRSV的分子流行病学的研究。巴西研究确定少量BRSV B组毒株，另一项研究表明英国分离株基因和美国毒株有关，两份报告都表明BRSV流行病学对全球进口活牛分子研究起的重要作用[18]。

综上所述，在过去二十年中BRSV的分子流行病学研究有很大发展。分子特性的研究以及BRSV株系统遗传和进化已经推进我们对于病毒和疾病传播的分子机制的研究，但该领域仍然需要广泛的研究来揭示病毒的持久性。BRSV在不同地理区域的分子监控的建立将有可能提高病毒暴发的识别，预防措施为了控制病情。新一代测序“DNA测序时代”可以发现宿主的病毒复制和生存的基本能力。

4 结束语

BRSV被认为是近几十年中引起牛呼吸系统疾病的重要病因，病毒基因组特异性和复制低保真度维持病毒在宿主内的生存和持续性。从临床标本中分离的病毒菌株，病毒颗粒通常有不稳定性，但分子生物学的方法可以成为BRSV在临床上正确识别和鉴定的金标准，BRSV在分子流行病学领域取得的显著的进步，可以增强我们在全球BRSV的分布和传输模式上的了解。总之，新分子学方法包括新一代测序的到来，将可能帮助揭开不同地理区域病毒基因的组成，以及病毒持久性传播的机制。

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Epidemiology,Molecular Epidemiology of Bovine Respiratory SyncytialVirus

Ma Lili,Ni Hongbo*
(College of animal science and technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319)

Bovine respiratory syncytial virus(BRSV)is an enveloped single strand RNA virus, the virus belongs to the members of the family Paramyxoviridae pneumovirus.Since the beginning of 1970s BRSV was confirmed to be the main reason of respiratory disease caused by the calf.Research facility BRSV many immunological and molecular biological methods.In spite of this in many ways,epidemiology,molecular epidemiology and the evolution of the virus is still not fully understood.The natural infection process complex and make the diagnosis more difficult,treatment needs better preventive measures to control the disease.Understanding BRSV infection to be able to establish a mechanism to prevent the spread of virus and disease.This paper reviews the important information about the epidemiology and molecular epidemiology of BRSV the virus evolution and highlighted the importance of transmission of the virus.

Bovine respiratory syncytial virus;Global distribution;Genotype;Evolution

S858.23

A

1672-9692(2016)11-0037-04

2016-10-09

马莉莉（1992-）,女，黑龙江人，在读硕士，研究方向为分子细菌学和免疫学。

倪宏波（1972-）,男，黑龙江人，教授，博士生导师，主要从事分子细菌学和免疫学研究。