携带blaCTX-M-65、rmtB和fosA3多重耐药质粒pHN7A8的适应性研究

何良英，刘兰平，曾振灵，刘健华

(华南农业大学兽医学院，广州510642)



携带blaCTX-M-65、rmtB和fosA3多重耐药质粒pHN7A8的适应性研究

何良英#，刘兰平#，曾振灵，刘健华*

(华南农业大学兽医学院，广州510642)

摘要：为分析携带blaCTX-M-65、rmtB和fosA3多重耐药质粒pHN7A8的适应性代价，将犬源大肠杆菌7A8的多重耐药质粒pHN7A8转化入大肠杆菌JM109中，获得转化子7A8JT，并采用生长曲线测定和竞争试验方法研究pHN7A8对宿主菌适应性的影响。结果表明，携带pHN7A8的转化子7A8JT和受体菌JM109的生长曲线相似，但前者对于后者有竞争优势，未发现质粒pHN7A8对宿主菌产生适应性代价。携带blaCTX-M-65、rmtB和fosA3的多重耐药质粒pHN7A8能在宿主菌中稳定传代，临床上应警惕大量使用或滥用抗菌药物对其形成的选择压力，以防止多重耐药质粒进一步扩散。

关键词：16S rRNA甲基化酶；超广谱β-内酰胺酶；多重耐药质粒；适应性

近年来，16S rRNA甲基化酶基因和超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)基因关系密切，常被报道位于同一个质粒上[1]。目前，在兽医领域也出现了两者共同传播的现象[2-3]。本课题组研究发现，宠物源和猪源肠杆菌中的rmtB和blaCTX-M传播主要由IncFⅡ质粒介导[4-5]，并发现新出现的磷霉素修饰酶基因fosA3与rmtB和blaCTX-M-65相连，位于同一质粒上[6]，且rmtB与blaCTX-M-65、fosA3等耐药基因构成的多重耐药(multidrug resistance，MDR)质粒已在宠物源及猪源肠杆菌中传播和扩散。本研究对已进行全序列测定的该类型质粒pHN7A8[7]进行适应性代价分析，探讨其广泛传播的成因，为临床控制多重耐药质粒的传播和扩散提供理论依据。

1材料与方法

1.1菌株及其质粒来源

多重耐药质粒pHN7A8来源于大肠杆菌7A8，为本实验室于2008年分离自宠物犬粪便样品。常规质粒接合试验和化学转化试验均无法获得pHN7A8单质粒接合子或转化子。使用质粒提取试剂盒(QIAGEN公司)提取质粒，经电泳切胶纯化后采用电转化将目的质粒pHN7A8转化入感受态大肠杆菌JM109中，获得转化子7A8JT[6]。采用琼脂稀释法分析受体菌、供体菌及转化子的药物敏感性。标准菌E.coliATCC®25922及工程菌E.coliJM109为本实验室保存。

1.2生长曲线的测定

将7A8JT和E.coliJM109划线培养后，分别挑取单菌落到2 mL空白LB肉汤中，37 ℃ 200 r·min-1过夜培养。分别测定7A8JT和E.coliJM109的母液OD值，取OD值最接近的母液进行下一步试验。从母液中吸取200 μL 接种到含20 mL新鲜LB肉汤的锥形瓶中，37 ℃ 200 r·min-1震荡培养。每1 h准确吸取200 μL到96孔板中，平行吸取三次，以空白的LB肉汤作为空白对照，测定OD600 nm。

1.3竞争生长试验

分别挑取7A8JT和E.coliJM109单菌落到4 mL LB肉汤中，37 ℃ 200 r·min-1过夜培养。取OD600 nm值最相近的初始培养物母液，以1∶1的比例均匀混合。取200 μL混合液接种到20 mL空白LB肉汤中(1∶100)，同时设6个平行，设此时为竞争试验0 d。37 ℃ 200 r· min-1震荡培养24 h后，取混合液200 μL接种到20 mL新鲜空白LB肉汤中(1∶100)。此操作每24 h重复一次，连续6 d。吸取已充分混匀的菌悬液200 μL，至含有1 800 μL 0.85%生理盐水的试管中，此即为10倍稀释，依次类推。立即向上述盛有不同稀释倍数菌液(10-6、10-7、10-8)的平皿中倒入空白培养基或含有100 μg·mL-1阿米卡星的培养基中，使培养基与菌液混合均匀，每个稀释度设三个平行进行菌落计数。

2结果

2.1转化子及原菌的药敏结果

原菌7A8对多种药物耐药，携带blaCTX-M-65、rmtB和fosA3的转化子7A8JT对头孢噻肟、庆大霉素、阿米卡星、氨苄西林的MIC值比受体菌的分别升高至少256倍、512倍、64倍和32倍。药敏结果见表1。

表1转化子及原菌对抗生素的敏感性

Table 1Susceptibitity of transformant and donor

2.2生长曲线测定

以时间(h)为横坐标，以不同时间点的平均OD600 nm值为纵坐标，绘制7A8JT和E.coliJM109生长曲线。结果显示，7A8JT和E.coliJM109母液的OD600 nm值分别为0.01和0.011，可认为两者母液浓度接近一致。此外，从迟缓期到对数期和稳定期，两者的OD600 nm值相等或相近，曲线趋于一致，表明7A8JT菌株生长能力接近于受体菌E.coliJM109。结果见图1。

2.3竞争试验

以采样时间为横坐标，转化子7A8JT和受体菌E.coliJM109的相对含量为纵坐标作图。结果显示，7A8JT和E.coliJM109的母液中，两者各占一半，六个平行的传代培养菌液中两者相对含量平均值为50%，表明竞争试验开始时7A8JT和E.coliJM109起始菌量一致。到传代培养第一天时，两者的相对含量保持在50%，表明7A8JT和JM109的共培养未出现竞争优势和劣势。直至第二天后，7A8JT逐渐呈现出优势，其相对含量在55%～66%之间变化。相比之下，不含pHN7A8的受体菌JM109的相对含量逐渐下降，表现出竞争劣势。结果见图2。

3讨论

适应性是指耐药菌在没有药物选择压力的情况下生长、定植等方面的能力。抗菌药物一般作用于细菌细胞壁的生物合成、染色体超螺旋的调节、RNA转录和蛋白质的生物合成，因此相关部位产生的耐药突变常常伴随着细菌适应性的下降，但有些却表现适应性增强。例如空肠弯曲杆菌的gyrA突变在介导其对喹诺酮类药物耐药的同时也使耐药菌表现出适应性的增强[8]。耐药质粒通常携带多种耐药基因，对宿主菌的生长代谢及其在环境中的适应性造成一定影响。细菌捕获耐药质粒后，通常伴随着适应性代价的产生[9]。耐药菌的适应性研究主要包括耐药菌是否能快速适应宿主或环境，能否在与敏感菌的生长竞争中成为优势菌群。

细菌的生长曲线描述了细菌群体从开始生长到死亡的动态变化过程，竞争试验反映了连续生长周期中菌株的竞争劣势，能够较准确地衡量适应性[10]。本研究通过测定转化子7A8JT和受体菌E.coliJM109的生长曲线和两者的竞争关系来分析多重耐药质粒pHN7A8对宿主菌产生的适应性代价。7A8JT和E.coliJM109表现出相似的生长能力，但转化子7A8JT相对于受体菌E.coliJM109具有竞争优势，表明菌株获得质粒pHN7A8后短期内不会有较强的适应性代价，宿主有可能适应机体或外界环境使得该质粒能够稳定存在于宿主中。质粒pHN7A8能够增强宿主菌适应性的原因可能是由于该质粒携带F33：A-：B-复制子[7]，为典型的IncFII型质粒的复制子结构，主要编码基因是copB(repA2)、repA1和repA4。携带此类复制子的典型质粒如pEK499(GenBank No.EU935739)、pC15-1a(GenBank No.AY458016)、R100(GenBank No.AP000342)。虽然F型质粒为窄宿主、低拷贝的大质粒(100 kb左右)，但常常携带多个复制子，如FII型质粒同时携带FIB和FIA型复制子。F型质粒通常编码多种毒力因子和耐药决定因子以提高宿主菌的适应性。可见，质粒pHN7A8的复制控制系统及其携带的多种耐药基因可能为减少宿主菌的适应性代价起到一定作用。其次，质粒沉溺系统可以修复质粒分配不稳定性，野生型耐药质粒不断累积并得以稳定传播的一大因素是质粒沉溺系统的作用。在本研究中，pHN7A8质粒上存在三种沉溺系统，pemI-pemK、sok-mok-hok和srnB，其中hok-sok质粒沉溺系统来源于大肠埃希菌质粒R1，为毒素-抗毒素基因组合，可提高质粒稳定性。在典型复制区上下游分别衔接沉溺系统srnB和pemk-pemI，进一步保证了该质粒在宿主菌传代中的稳定分配及遗传。因此，质粒pHN7A8能够在宠物源及猪源肠杆菌中传播和扩散，可能与其能够提高宿主菌的适应性有关。此外，质粒pHN7A8同时携带rmtB、blaCTX-M-65和fosA3等耐药基因，提示多种抗生素的选择压力可能有助于其形成与传播，因此临床上应警惕大量使用或滥用抗菌药物对其形成的选择压力，以防止多重耐药质粒进一步扩散。联合使用中药可能有助于耐药性的缓解[11]。

4结论

携带blaCTX-M-65、rmtB和fosA3多重耐药质粒pHN7A8在宿主菌JM109中能稳定传代。

参考文献(References)：

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(编辑白永平)

Fitness Cost of a Multidrug Plasmid CarryingblaCTX-M-65，rmtB，andfosA3

HE Liang-ying#，LIU Lan-ping#，ZENG Zhen-ling，LIU Jian-hua*

(CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

Key words:16S rRNA methylases；extended-spectrum β-lactamases；multidrug resistance encoding plasmids；fitness cost

Abstract:The objective of this study was to examine the fitness cost of a multidrug plasmid pHN7A8 carryingblaCTX-M-65，rmtB，andfosA3.Plasmid pHN7A8 carryingblaCTX-M-65，rmtB，andfosA3 fromE.coli7A8 was transferred intoE.coliJM109 by electroporation.Transformant 7A8JT containing pHN7A8 was obtained.Growth curve and growth competition experiments were performed to assess the fitness cost of pHN7A8 upon its host.Growth curve showed no significant difference between the transformant carrying pHN7A8 and sensitive recipientE.coliJM109.Competition experiments betweenE.coliJM109 strain and transformant 7A8JT revealed a competitive advantage for the transformant versus the recipient.The results showed that no fitness cost was observed for plasmid pHN7A8.More attention should be taken into account the effect of the clinical use of antibiotics on the selection of multidrug resistance encoding plasmids.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.023

收稿日期：2015-02-16

基金项目：973项目(2013CB127200)；国家自然科学基金广东省联合基金重点项目(U1031004)；广东省高等学校高层次人才项目

作者简介：何良英(1986-)，女，广西南宁人，博士，主要从事细菌耐药性、新型环境污染物的微生物降解研究，E-mail:heliangying@163.com；刘兰平(1989-)，女，硕士生，主要从事细菌耐药性研究。二人对本文贡献相同 *通信作者：刘建华，教授，硕士生导师，Tel:(86-20)-85283824，Fax:(86-20)-85283824，E-mail：jhliu@scau.edu.cn

中图分类号：S852.612

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0172-05