狼山鸡NLRC5基因启动子区SNP及其在先天免疫中的效应分析

刘向萍，郭晓敏，李志腾，朱　静，盛中伟，马　腾，常国斌，窦新红，王克华，陈国宏*

(1.江苏省家禽科学研究所，扬州 225125； 2.扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009)



狼山鸡NLRC5基因启动子区SNP及其在先天免疫中的效应分析

刘向萍1#，郭晓敏2#，李志腾2，朱静1，盛中伟1，马腾2，常国斌2，窦新红1，王克华1，陈国宏2*

(1.江苏省家禽科学研究所，扬州 225125； 2.扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009)

摘要：旨在通过检测狼山鸡NLRC5基因启动子区单核苷酸多态位点，确定不同基因型的遗传效应，并经过后代分离群体验证，以期筛选与先天免疫性状相关的遗传标记。本研究采用MALDI-TOF-MS技术对狼山鸡群体NLRC5基因启动子区SNPs位点进行扫描；同时测定部分免疫性状，分析不同基因型个体免疫性状的差异。结果发现，在g.628981处存在A/G突变，共AA、AG和GG 3种基因型，狼山鸡不同基因型免疫指标间存在显著差异，AA基因型个体的H/L值显著低于GG基因型个体，而胸腺指数、脾脏指数、淋巴细胞转化率和IgG含量均显著高于GG基因型个体(P<0.05)；在F2代AA和GG两个分离群体中同样发现AA型个体各项性状值均优于GG型个体。结合NLRC5基因在胸腺与脾组织中转录水平的差异，表明AA基因型个体表现出较好的先天免疫性能，NLRC5基因g.628981 (A/G)位点可作为先天免疫性状有效的遗传标记。

关键词：鸡；NLRC5基因；多态性；先天免疫

NLRC5蛋白是先天免疫系统中核苷酸结合寡聚结构域样受体NLR(Nod-like receptor)家族的成员之一[1]，属细胞内信号转导受体，在免疫组织和器官中高水平表达，具有完整的传递识别病原体信号到引起特定的下游效应信号的能力[2]。NLRC5蛋白能够通过阻止NF-κB通路中的IKKa和IKKb两种关键激酶的磷酸化以及抑制IFN信号通路中外源RNA受体RIG-I和MDA5蛋白复合物的形成，从而达到抑制因这两条通路活化所产生的炎症反应[3]。NLRC5负向调控炎症反应引起了国内外学者的关注，T.B.Meissner等[4]、E.Meylan等[5]在人和小鼠中均发现：NLRC5基因是调控先天免疫的关键分子，在动物机体的先天免疫中发挥重要作用。而且，人类NLRC5基因位点上的遗传变异一定程度影响着炎症或者某些传染性疾病的易感性和防御性[6]，但至今关于禽类NLRC5基因的变异及其在先天免疫中的功能研究报道较少[7-8]。在现代家禽生产中，因各种因素导致的炎症与先天免疫功能的损伤已成为困扰产业发展的突出问题。

鉴于NLRC5基因在维持先天性免疫稳态及其抑制炎症反应中发挥着极为重要的作用。本研究以狼山鸡为研究素材，采用MALDI-TOF-MS技术对狼山鸡群体的NLRC5基因启动子区SNPs位点进行扫描，并且测定免疫指数(胸腺指数和脾脏指数)、淋巴细胞转化率、异嗜性粒细胞/淋巴细胞比率(Heterophil/Lymphocyte，H/L)、IgG和IgM 6个免疫性状，分析不同基因型免疫性状的差异以及该基因的多态性对于免疫性状的影响，以期为鸡的抗病育种研究提供基础资料。

1材料与方法

1.1试验材料

本试验鸡群来自江苏如东狼山鸡国家级保种场，选用同批出雏的健康狼山鸡第一世代，按照常规饲养方式饲养，整个试验期鸡群健康状况良好，没有发生疾病和其他不良情况。免疫程序见表1。在12周龄测定各免疫性状值。按照第一世代NLRC5基因分型结果，根据基因型留种，公母比例1∶10，相同基因型个体间实行随机交配与各家系等数留种得到第二世代，2种基因型个体在同一条件下饲养，营养水平和免疫程序相同，选取1、6、12周龄的每种基因型个体各20只(10公10母)进行屠宰。屠宰后取胸腺、脾组织，立即投入液氮速冻，速冻后样品于-70 ℃冰箱保存备用。

表1鸡群试验期免疫程序

Table 1Immune procedure of experimental birds

1.2免疫性状的测定

1.2.1免疫指数的测定称取左胸腺和脾重量，与体重比较所得比值即为胸腺指数和脾脏指数，单位：g·kg-1。

1.2.2H/L值的测定翅静脉采血后立即做血涂片，用改良瑞氏染色液(聚乙烯吡咯酮9.9 g，加入500 mL甲醇中，摇匀使其溶解。待全部溶解后加入瑞氏染粉2 g，摇匀，溶后即可使用)染色[9]。镜检，按照M.L.Alfred等[10]的白细胞分类方法进行细胞分类，并按照J.L.Campo等[11]的方法进行计数和计算。

1.2.3淋巴细胞转化率的测定[12]采用MTT法测定淋巴细胞转化率，每个样本做3次重复，采用全自动生化分析仪(卓越330，南京科华公司)检测在570 nm处的吸光值。

1.2.4IgG和IgM含量的测定常规分离血清后，采用ELISA试剂盒法，利用全自动生化分析仪在450 nm处测定吸光值，绘制标准曲线，计算相应样本浓度。

1.3DNA提取

翅静脉采血0.4 mL，肝素钠抗凝，加裂解液4 mL，用酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，溶于TE中，4 ℃冷藏备用。

1.4MALDI-TOF-MS基因分型

根据GenBank鸡NLRC5基因(ID：100857413)启动子序列(g.627212-630962)，通过混合样本测序、NCBI 的SNP 数据库筛选等方法，利用美国Sequenom 公司Sque-nomMassARRAY®分子量阵列平台中iPLEXGOLD3.1软件，对每个位点设计多重PCR反应的特异引物和单碱基延伸所用的延伸引物，软件自动计算Tm 值、引物长度、PCR 产物长度和延伸产物分子量大小。具体引物信息见表2(不包含无多态位点信息)。

表2SNPs位点的质谱技术基因型分型引物

Table 2Primers information of SNPs genotyping by MALDI-TOF-MS

1.5荧光定量

按照Trizol法提取各组织中总RNA，使用Nanodrop 1000(Thermo Fisher公司)检测RNA的浓度和质量。根据FastQuant RT Kit(with gDNase)试剂盒(北京天根生化有限责任公司)说明书进行逆转录合成第一链cDNA，产物cDNA置于冰上用于后续试验或低温保存。

荧光定量PCR以β-actin为内参基因，采用SYBR Green I染料法，试剂盒使用UltraSYBR Mixture(With ROX)CW0956(北京康为世纪生物科技有限公司)，使用ABI 7500荧光定量PCR仪。20 μL反应体系：2×UltraSYBR Mixture(With ROX)10 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，模板2 μL，RNase-Free Water 6 μL，每个样品设4个重复。荧光定量分析的引物信息见表3。采用两步法进行PCR扩增，反应条件：95 ℃预变性10 min； 95 ℃变性15 s，60 ℃退火 1 min，循环40次；根据熔解曲线上单一峰的有无判断PCR扩增的特异性。相对定量的结果采用2-ΔΔCt方法进行处理。

表3用于荧光定量分析的引物信息

Table 3Primer sequences for Q-PCR

1.6数据统计与分析

统计基因型和等位基因频率，并对基因型分布差异进行卡方检验和Hardy-Weinberg平衡检测，利用Align IR (v 2.0)软件进行序列比对和SNP位点分析。利用SPSS13.0软件One-Way ANOVA法对不同基因型个体间免疫性状差异进行方差分析，数据以“平均值±标准误”表示。

2结果

2.1MALDI-TOF-MS飞行质谱分型

对NLRC5基因的启动子区进行SNP扫描，结果发现，在第一世代143只狼山鸡群体中，仅在g.628981处检测出SNPs，呈现3种基因型，AA、AG和GG，其频率分别为0.53、0.43和0.04，表明MALDI-TOF-MS飞行质谱检出率达到100%，结果可靠。其中，AA型个体的序列与GenBank中的序列一致，GG型为突变基因型，野生与突变等位基因频率分别为0.745和0.255。经卡方适合性检验，群体NLRC5基因的等位基因频率分布处于Hardy-Weinberg平衡状态(P=0.345)。

2.2不同基因型个体间免疫性状的比较

对狼山鸡群体NLRC5基因启动子区不同基因型与免疫性状进行关联分析，结果见表4和表5。在第一世代中，狼山鸡不同基因型的免疫指标间存在显著差异，AA基因型个体的H/L值显著低于GG基因型；而胸腺指数、脾脏指数、淋巴细胞转化率与 IgG含量均显著高于GG基因型(P<0.05)；第二世代中，1～12周龄，AA与GG基因型之间相应的免疫指标同样存在显著差异(P<0.05)，呈现出与第一世代类似的趋势，进一步表明AA基因型个体表现出较好的先天免疫性能。

表4第一世代不同基因型个体间免疫性状的差异比较

Table 4Comparisons of immunity index of individuals with different genotypes in F1generations

同一列不同字母表示差异显著 (P<0.05)。下同

Values in the same column with different superscript letters mean significant difference(P<0.05).The same as below

表5第二世代不同基因型个体间免疫性状的差异比较

Table 5Comparisons of immune traits of individuals with different genotype in F2generations

2.3不同基因型之间NLRC5表达比较

由图1可知，第一世代与第二世代中各个生长阶段胸腺与脾组织中，AA基因型个体NLRC5基因的表达水平大都显著高于GG型个体。在不同周龄的胸腺组织中，AA基因型与GG型个体间表达差异水平基本稳定，而在脾组织中，两种基因型在前期差异水平较低，后期差异水平逐步增加，基本反映了鸡的胸腺与脾组织发育的特点，胸腺作为中枢免疫器官，早在胚胎期开始发育，而脾为外周免疫器官，发育相对迟，同时也表明NLRC5基因与鸡先天免疫功能的相关性。

3讨论

NLRC5作为NLRs家族中分子结构最庞大的一员，引起诸多学者的关注，现有报道均证明该基因对动物机体的天然免疫反应起关键作用[13]，但作为家禽细胞内主要的免疫信号受体，其功能至今未阐明。本课题组先后克隆出鸡NLRC5序列全长转录本，并提交至GenBank(登录号：JQ044414)，同时发现鸡NLRC5与哺乳动物同源性较低，其转录、表达水平亦存在差异[14]；因此本研究针对NLRC5启动子序列进行SNPs扫描，探讨该基因转录调控机制及其相应功能。研究发现，在狼山鸡群里共检测到3种基因型，2个等位基因，且处于Hardy-Weinberg平衡状态。AA基因型为野生型，其序列与红色原鸡一致；AA基因型个体在两个世代鸡群的胸腺与脾组织中mRNA 表达水平显著高于突变型个体，这表明该SNP位点可能影响机体的免疫功能。

本研究选取胸腺指数、脾脏指数作为检测鸡免疫器官发育差异的主要指标。胸腺的免疫功能主要是诱导T细胞的分化、成熟以及抗体的产生，脾作为抗体产生的主要组织，60%的B细胞由脾产生[15]。丁雁等[16]研究发现，胸腺指数和脾脏指数可直接反映免疫器官的发育状态，与机体先天免疫密切相关。研究表明，肉鸡和蛋鸡的胸腺指数、脾脏指数遵循先变大后逐渐变小，最终达到一个平衡的状态规律，其中胸腺指数值最大[17-18]，这与本研究的结果基本一致，表明本研究的试验设计与免疫程序比较合理，并未影响免疫器官的正常发育规律。在两个世代鸡群里，AA基因型个体的胸腺指数、脾脏指数均显著高于GG型个体，表明不同基因型之间免疫器官发育存在一定的差异。同样，在NLRC5 mRNA 表达水平方面，无论是在第一世代还是后代分离群体中任何发育阶段，均发现两种基因型存在差异；虽然在小鼠等其他动物中未见相关报道，但从本研究结果可以认为NLRC5启动子区突变通过对其转录水平调控进而影响鸡免疫性能。

在先天免疫性能指标方面，本研究以淋巴细胞转化率、H/L值、IgG和IgM 4个性状值作为评判依据。淋巴细胞转化率值的高低反映机体细胞免疫功能的好坏，这在人类疾病诊断中已经得到了广泛应用[19-20]。本研究发现，1周龄狼山鸡的淋巴细胞转化率最小，而12周龄时最大，这表明随着日龄的增加，机体抵抗外界病原微生物的能力正在增加。AA基因型个体在各个阶段均表现出较高的淋巴细胞转化率，与GG型存在显著差异，表明两种基因型在抵抗病原微生物能力方面存在差异。H/L值是细胞介导免疫的重要性状之一，可以作为应激反应和抗逆性的指标。王存波等[21]研究表明，文昌鸡和狼山鸡的免疫抗应激和抗病性优于外来品种安卡鸡。本研究结果表明，狼山鸡中AA基因型个体的H/L值显著低于GG型，表明野生型抗应激能力要优于突变型。免疫球蛋白方面，AA基因型个体IgG含量显著高于GG型，IgM含量在两种基因型个体间差异虽然不显著，但总体上反映了不同基因型鸡只体液免疫应答的能力差异，H.K.Parmentier等[22]证实，IgG等免疫球蛋白水平高的群体对感染性疾病的抗性优于低的群体；综合上述性状差异分析表明，不同基因型个体间免疫功能确实存在一定差异，且野生型个体先天免疫性能优于突变型。另外，在飞行质谱结果中发现，在红色原鸡、藏鸡、茶花鸡等野生种群以及近缘种群里只有野生基因型这一类型，而在现代商用白羽肉鸡群体中只有突变型(未发表)，这也充分表明野生型鸡种——红色原鸡、藏鸡、茶花鸡等具有先天免疫性能较强的特点。但是对于AA型成为有利基因型的遗传机制还需要进一步研究，通过NLRC5基因调控区与转录因子的结合机制进行深入分析，探明NLRC5基因在不同种群中的转录调控机制，为鸡的抗病育种研究提供了重要参考依据。

参考文献(References)：

[1]AKIRA S，UEMATSU S，TAKEUCHI O.Pathogen recognition and innate immunity[J].Cell， 2006，124(4)：783-801.

[2]CUI J，ZHU L，XIA X，et al.NLRC5 negatively regulates the NF-kappaB and type I interferon signaling pathways[J].Cell，2010，141(3)：483-496

[3]席琼，胡巢凤.NOD样受体在炎症反应中的调控作用[J].生命科学，2010，22(5)：454-458.

XI Q，HU C F.Regulation of NOD like receptors in the inflammation[J].ChineseBulletinofLifeSciences，2010，22(5)：454-458.(in Chinese)

[4]MEISSNER T B，LI A，BISWAS A，et al.NLR family memberNLRC5 is a transcriptional regulator of MHC class I genes[J].ProcNatlAcadSciUSA，2010，107(31)：13794-13799.

[5]MEYLAN E，TSCHOPP J，KARIN M.Intracellular pattern recognition receptors in the host response[J].Nature，2006，442(7098)：39-44.

[6]CRISTOFARO P，OPAL S M.Role of Toll-like receptors in infection and immunity：clinical implications[J].Drugs，2006，66(1)：15-29.

[7]MA T，CHANG G B，CHEN R，et al.Identification of key genes in the response to Salmonella enterica Enteritidis，Salmonella enterica Pullorum，and Poly(I：C) in chicken spleen and caecum[J].BiomedResInt，2014，2014：154946.

[8]常国斌，陈蓉，栾德琴，等.细菌内毒素对鸡NLRC5受体及IFN基因转录的影响[J].畜牧兽医学报，2011，42(11)：1598-1604.

CHANG G B，CHEN R，LUAN D Q，et al.Transcription change of chickenNLRC5 receptor andIFNgenes initiated by bacterial endotoxins[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2011，42(11)：1598-1604.(in Chinese)

[9]董书魁，贾天宠.改良的MGG染色液[J].北京军区医药，1996，8(1)：77.

DONG S K，JIA T C.Improved MGG dye liauor[J].MedicalJournalofBeijingMilitaryRegion，1996，8(1)：77.(in Chinese)

[10]ALFRED M L，CASIMIR J.Atlas of avian hematology[M].Washington：United States Department of Agriculture，1961.

[11]CAMPO J L，DAVILA S G.Estimation of heritability for heterophil：lymphocyte ratio in chickens by restricted maximum likelihood.Effects of age，sex and crossing[J].PoultSci，2002，81(10)：1448-1453.

[12]王德云，胡元亮，孔祥峰，等.复方中药成分对新城疫疫苗免疫雏鸡外周血T淋巴细胞转化和血清抗体效价的影响[J].中国兽医学报，2006，26(2)：194-196.

WANG D Y，HU Y L，KONG X F，et al.Effect of Chinese herbal medicinal ingredient prescription on peripheral T lymphocyte transformation and serum antibody titer of chickens inoculated with ND vaccine[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2006，26(2)：194-196.(in Chinese)

[13]MEDZHITOV R.Recognition of microorganisms and activation of the immune response[J].Nature，2007，449(7164)：819-826.

[14]马腾，常国斌，陈蓉，等.鸡NLRC5基因克隆及生物信息学分析[J].中国畜牧杂志，2013，49(13)：24-27.

MA T，CHANG G B，CHEN R，et al.Clone and bioinformatics analyzing of NLRC5 in chicken[J].ChineseJournalofAnimalScience，2013，49(13)：24-27.(in Chinese)

[15]王米，杨锐乐，张丽芳，等.蛹虫草多糖对鸡脾脏淋巴细胞的影响[J].中国家禽，2014，36(5)：20-23.

WANG M，YANG R L，ZHANG L F，et al.Effects ofCordycepsmilitarispolysaccharides on splenic lymphocytes in chicken[J].ChinaPoultry，2014，36(5)：20-23.(in Chinese)

[16]丁雁，邢善田，周金黄.淫羊藿多糖和甙的胸腺免疫药理作用[J].中国药理学通报，1993，9(5)：342-345.

DING Y，XING S T，ZHOU J H.Immunopharmacologic effects of epimedium polysaccharide and icarrin on mouse thymus[J].ChinesePharmacologicalBulletin，1993，9(5)：342-345.(in Chinese)

[17]吴悦，陈俭清，李鹤，等.连翘酯苷对脂多糖诱导的鸡胸腺组织抗氧化功能的影响[J].中国家禽，2013，35(19)：15-18.

WU Y，CHEN J Q，LI H，et al.Effects of forsythiaside on antioxidant function induced by lipopolysaccharide in thymus tissue of chickens[J].ChinaPoultry，2013，35(19)：15-18.(in Chinese)

[18]杨小燕，林跃鑫，李焰.银杏叶提取物对肉鸡生产性能、屠宰性能和免疫指标的影响[J].福建农林大学学报(自然科学版)，2008，37(3)：295-298.

YANG X Y，LIN Y X，LI Y.Effect of ginkgo biloba extract on growth performance，slaughter performance and immune index in broilers[J].JournalofFujianAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEdition)， 2008，37(3)：295-298.(in Chinese)

[19]AL-MURRANI W K，AL-RAWI A J，AL-HADITHI M F，et al.Association between heterophil/lymphocyte ratio，a marker of ‘resistance’ to stress，and some production and fitness traits in chickens[J].BrPoultSci，2006，47(4)：443-448.

[20]MANTANI N，KOGURE T，TAMURA J，et al.Lymphocyte transformation test for medicinal herbs yields false-positive results for first-visit patients[J].ClinDiagnLabImmunol，2003，10(3)：479-480.

[21]王存波，王克华，包文斌，等.不同鸡种间部分免疫性状的比较[J].中国兽医学报，2010，30(3)：317-322.

WANG C B，WANG K H，BAO W B，et al.Comparison of some immune traits among different chicken breeds[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2010，30(3)：317-322.(in Chinese)

[22]PARMENTIER H K，LAMMERS A，HOEKMAN J J，et al.Different levels of natural antibodies in chickens divergently selected for specific antibody responses[J].DevCompImmunol，2004，28(1)：39-49.

(编辑郭云雁)

SNPs of Promoter Region ofNLRC5 Gene and Its Genetic Effect on Innate Immune Traits in Langshan Chicken Breeds

LIU Xiang-ping1#，GUO Xiao-min2#，LI Zhi-teng2，ZHU Jing1，SHENG Zhong-wei1，MA Teng2，CHANG Guo-bin2，DOU Xin-hong1，WANG Ke-hua1，CHEN Guo-hong2*

(1.JiangsuInstituteofPoultrySciences，Yangzhou225125，China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

Key words:chicken；NLRC5 gene；polymorphism；innate immune

Abstract:This study was conducted to detect single nucleotide polymorphisms(SNPs)inNLRC5 gene promoter region of Langshan chicken，and further determine genetic effects of different genotypes which were verified by progeny segregating group，aiming to develop genetic markers associated with innate immune traits.MALDI-TOF-MS method was applied to scan SNPs inNLRC5 gene promoter region；afterwards，some immune traits and their differences between individuals with different genotypes were analyzed.The SNP scanning results found A/G mutation at g.628981 site，along with 3 genotypes，namely，AA，AG and GG.The immune indexes presented significant difference among individuals with different genotypes.The H/L value of individuals with AA genotype was significantly lower than that of individuals with GG genotype，but spleen index，thymus index，lymphocyte transformation rate and content of IgG were significantly higher than that of individuals with GG genotype (P<0.05)；it was also found that the traits of individuals with AA genotype were better than that of individuals with GG genotype in F2generation of AA and GG segregating groups.Collectively，combining with the transcription differences ofNLRC5 gene in thymus and spleen tissues，our study indicate that birds with AA genotype show better performances of innate immunity and g.628981(A/G) site ofNLRC5 gene can be used as an effective genetic marker of innate immune traits.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.006

收稿日期：2015-01-26

基金项目：国家自然科学基金(31301966)；“十三五”国家科技计划课颗(2015BAD03B03)

作者简介：刘向萍(1977-)，女，江苏张家港人，副研究员，主要从事家禽遗传资源评价、保护与利用研究，E-mail：poultry@163.com;郭晓敏(1990-)，女，河北魏县人，硕士生，主要从事家禽遗传资源评价、保护与利用研究，E-mail：1083866231@qq.com。刘向萍和郭晓敏为并列第一作者 *通信作者：陈国宏，教授，E-mail：ghchenyzdx@163.com

中图分类号：S813.2

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0041-07