寿光鸡GPR147基因5′调控区多态性与产蛋性状的关联分析

贾美婷，李显耀，康　丽，姜运良，樊新忠，唐　辉

(山东农业大学动物科技学院，泰安 271018)



寿光鸡GPR147基因5′调控区多态性与产蛋性状的关联分析

贾美婷，李显耀，康丽，姜运良，樊新忠，唐辉*

(山东农业大学动物科技学院，泰安 271018)

摘要：为了了解GPR147基因多态性及其与产蛋性状的关系，本试验以寿光鸡为试验材料，用直接测序的方法检测了寿光鸡该基因5′调控区的SNPs，并与产蛋性状进行了关联分析。结果发现，GPR147基因的5′ 调控区在鸡群中共有11个SNPs位点，其中-593和-579位点的不同基因型在后期(45～56周)产蛋量和56周总产蛋数有显著差异(P<0.05)；-593位点TT基因型对应较高产蛋数，-579位点AA基因型对应较高产蛋数。上述两个位点的单倍型分析结果表明，单倍型TA与CG相比，中期(26～44周)产蛋量多了1.5枚(P=0.041 8)，后期产蛋量多2.5枚(P=0.032 6)，300天产蛋量多1.6枚(P=0.1)，56周总产蛋量多4.4枚(P=0.014 4)。综上，GPR147 5′ 调控区存在丰富的SNPs位点，-593和-579位点SNPs及其单倍型对寿光鸡的产蛋性状有显著影响，是具有潜在应用价值的分子标记。

关键词：鸡；产蛋性能；GPR147基因；多态性

促性腺激素抑制激素(GnIH)是2000年K.Tsutsui等在日本鹌鹑中发现的一种下丘脑十二肽，能够抑制促性腺激素的合成和释放[1]。研究显示，GnIH广泛存在于鸟类、鱼类及哺乳动物的下丘脑——垂体——性腺轴(HPG轴)上[2-5]，通过多种方式参与生殖调控[6-7]。T.Ikemoto等和J.A.Bonini等报道鸡的GnIH有两种受体(RFRPR和NPFFR)，其中RFRPR又称为GPR147基因，主要在垂体表达[8-9]。GnIH与其受体GPR147结合，抑制腺苷酸环化酶活性，从而降低细胞内cAMP水平，干扰G蛋白耦联受体(包括GnRH、LH、FSH受体)信号传导[10]。T.Osugi等研究发现，给麻雀注射GnIH能快速减少血浆LH水平，同时注射GnIH和鸡促性腺激素释放激素I(cGnRH-I)，能降低GnRH诱导的血浆LH的升高水平[2]。T.Ubuka等研究表明，白冠雀和鹌鹑腹内注射GnIH后，LH浓度降低，鹌鹑LHα、LHβ和FSHα亚单位的mRNA表达量显著减少[11]。因此推测，GnIH可以通过直接或间接作用抑制促卵泡激素(FSH)和促黄体激素(LH)的合成与释放，继而影响雌激素的合成。这些激素共同作用影响生殖器官的发育，进而对蛋鸡的产蛋水平产生影响。

近年来，有关GnIH及其受体GPR147的研究主要停留在神经内分泌调控上，对鸡GPR147基因5′调控区多态性及其与产蛋性状关系的研究还未见报道。本研究以寿光鸡为试验材料，研究其GPR147基因5′调控区的SNPs，并与产蛋性状进行关联分析，为地方鸡产蛋性状分子标记辅助选择提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物本试验鸡群来自山东寿光慈伦大鸡养殖场，选取有完整的开产日龄及每日产蛋情况记录的样本432只。所有参试鸡群单笼饲养，饲养管理条件相同。

1.1.2主要试剂PJET1.2 Vector、DNA凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，感受态细胞E.coliDH5α、PrimerSTAR HS DNA Polymerase购自TaKaRa公司。

1.2DNA提取

50周龄时经翅静脉采血后，根据血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA。用紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度与纯度，于-20 ℃保存。

1.3引物设计

根据GenBank上发表的鸡GPR147基因序列(登录号：NC_006093.3)，在5′侧翼序列设计引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列：正向引物(F)：5′-GCTGCTACTGTCACCTGA-GG-3′；反向引物(R)：5′-GGAGAAACCGCAATGAAAGGAG-3′。

1.4PCR扩增和SNPs位点检测

根据产蛋记录，选取30个产蛋性状差异较大个体的DNA样品，混池后进行PCR扩增。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，63.5 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA凝胶回收试剂盒回收，并与PJET1.2 Vector连接。将连接产物转化至感受态细胞E.coliDH5α，通过菌液PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆菌送至北京华大基因有限公司进行测序，检测多态性位点。用TFSEARCH在线软件预测可能的转录因子结合位点(可能性大于85%)。

1.5多态性位点的群体检测与基因分型

每个个体PCR扩增GPR147基因5′调控区序列，PCR产物直接送北京华大基因有限公司测序，检测其多态位点基因型。

1.6数据处理

根据产蛋率是否高于60%，将产蛋期分为前期(20～25周龄)、中期(26～44周龄)和后期(45～56周龄)3个阶段，统计各阶段每只鸡产蛋数，300 天产蛋数及产蛋全期总产蛋数。

用R软件的Genetics程序包来计算分析各个多态位点的群体遗传学特征。用SAS8.2软件包的GLM程序将不同多态位点及其单倍型与产蛋性状进行关联分析，统计模型：Yij=μ+Gi+eij，其中，Yij为性状表型值，μ为该性状的总体均值，Gi为基因型效应值，eij为随机残差效应[12]。计算基因的加性效应、显性效应，并进行t检验分析。用PHASE软件(V2.0)估计每个个体多态位点的单倍型。

2结果

2.1GPR147基因的多态性

混池模板PCR扩增后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，片段大小与911 bp相符，特异性好。单克隆测序结果发现，寿光鸡GPR147基因5′调控区有11个SNP位点：-660(G→A)、-602(C→T)、-593(T→C)、-579(A→G)、-562(C→A)、-523(T→G)、-516(A→G)、-489(A→G)、-435(C→T)、-427(T→G/C)、-357(G→C/A)。根据测序结果可以判断个体基因型，单峰为纯合子，双峰为杂合子[13](图2)。

各位点用TFSEARCH在线软件预测，发现突变后-660位点失去CDP CR转录因子结合位点(得分为88.1)，-602位点失去USF转录因子结合位点(得分为86.6)，-579位点失去GATA-1(得分为91.0)和GATA-2(得分为90.9)转录因子结合位点，-562、-489位点失去MZF1(得分分别为89.6、85.2)转录因子结合位点，-427位点失去RORalp转录因子结合位点(得分为87.5)。其余位点碱基突变后，转录因子结合位点没有变化，其中-593位点的转录因子结合位点为GATA-1(得分为98.4)和GATA-2(得分为87.0)。

2.2GPR147基因5′调控区SNPs位点在寿光鸡群体中的分布

GPR147基因5′调控区SNPs位点群体遗传学分析结果见表1。χ2检验表明，-602、-562、-523三个多态位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)，其余位点未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)。-660、-593、-579位点的多态信息含量分别为0.25、0.27和0.26，呈中度多态(0.25≤PIC<0.5)，其余位点均呈低度多态(PIC<0.25)[14]。

表1GPR147基因5′调控区SNPs位点的群体遗传学分析结果

Table1The results of population genetic analysis on SNPs in 5′UTR ofGPR147

用SHEsis软件分析各位点间的连锁关系，发现-602、-562、-523三个位点完全连锁(D′=1，r2=1)[14]，-516、-489两个位点完全连锁(D′=1，r2=1)，-593和-579位点不完全连锁(D′=1，r2=0.928)。

2.3单位点多态性与寿光鸡产蛋性状的关联分析

对寿光鸡群体GPR147基因-593和-579两个多态位点的单位点与产蛋性状进行关联分析，结果见表2。由表2可知，-593和-579位点的不同基因型在后期产蛋量和56周总产蛋数有显著差异(P<0.05)。在-593位点，TT型个体后期产蛋数比CC型多4.3枚，比CT型多4.7枚；TT型个体56周产蛋数比CC型多6.1枚，比CT型多6.5枚。等位基因T与C相比能使鸡后期产蛋数增加2.2枚，56周产蛋总数增加3.0枚。-579位点AA基因型对应较高产蛋数，AA型个体后期产蛋数比AG型多4.1枚，比GG型多5.1枚；56周产蛋数AA型个体比AG型多4.4枚，比GG型多8.8枚；等位基因A与等位基因G相比能使鸡的中期产蛋量增加1.5枚，后期产蛋数增加2.5枚，56周产蛋总数增加4.4枚。

其余低度多态位点，由于基因型频率差别太大，分析结果没有代表性，因此未作关联分析。

表2不同位点基因型对产蛋性状的最小二乘均数及等位基因的遗传效应

Table 2Least squares means and allele genetic effects for laying traits at each locus

P<0.05表示该位点在该性状不同基因型之间差异显著；同一位点同一列标有不同字母的两均数间差异显著(P<0.05)。*.P<0.05；**.P<0.01。AE为加性效应的缩写；DE为显性效应的缩写。下表同

P<0.05 indicates that different genotypes at this locus differ significantly in this trait.Value within the same column at the same locus with different superscripts differ significantly (P<0.05).*.P<0.05；**.P<0.01.AE.Additive effect；DE.Dominant effect.The same as below

2.4多位点联合基因型及单倍型对寿光鸡产蛋性能的效应分析

在该群体中，-593和-579位点有4种联合基因型：TA/TA、TA/CG、CA/CG、CG/CG，其中CA/CG型只有10个个体，频率低于5%，因此不作分析。对其他3种联合基因型与产蛋性状进行关联分析，结果见表3。由表3可知，-593、-579位点不同联合基因型对后期产蛋数和56周总产蛋量有显著影响(P<0.05)，表现为后期产蛋数TA/TA型比TA/CG型多4.7枚，比CG/CG多5.1枚，总产蛋数TA/TA型比TA/CG型多6.5枚，比CG/CG多8.8枚。加性效应及显性效应分析结果发现，单倍型TA与单倍型CG相比，中期产蛋量多1.5枚(P=0.041 8)，后期产蛋量多2.5枚(P=0.032 6)，300天产蛋量多1.6枚(P=0.1)，56周总产蛋量多4.4枚(P=0.014 4)。

表3两个位点联合基因型的最小二乘均数及单倍型的遗传效应

Table 3Least squares means by combined genotypes and haplotype genetic effects

3讨论

本研究在寿光鸡GPR147基因5′调控区发现了11个SNPs位点，其中3个为中度多态，8个为低度多态，并且哈代温伯格平衡检验发现只有3个位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)，原因可能与该群体的育种措施造成的偏离有关。在群体中发现，-602、-562、-523位点只有两种基因型，可能是该群体的人工选择造成的。

本研究发现，-579位点多态性对56周产蛋量和后期产蛋量有显著影响(P<0.05)。TFSEARCH在线软件预测发现，-579位点由碱基A突变成碱基G后，失去GATA-1(得分为91.0)和GATA-2(得分为90.9)转录因子结合位点。哺乳动物研究表明，GATA家族对类固醇发生、性别决定和分化等过程有着不可或缺的作用[15]。小鼠GATA-2基因通过与PIT1相互作用，调节生长激素细胞、催乳素细胞、促性腺激素细胞和促甲状腺激素细胞的生成，并能降低促性腺激素细胞中LHβ的表达[16-19]。因此-579位点很可能是因为失去GATA-1和GATA-2转录因子结合位点影响了基因表达。-593位点由碱基T突变成C，转录因子结合位点没有变化，为GATA-1(得分为98.4)和GATA-2(得分为87.0)，其多态性对产蛋性状的影响可能是通过转录因子结合方式的改变或与其他位点(比如-579位点)连锁造成的。

单位点多态性分析，-593位点等位基因T与C相比能使鸡后期产蛋数增加2.2枚，56周产蛋总数增加3.0枚。-579位点等位基因A与G相比能使鸡的中期产蛋量增加1.5枚，后期产蛋数增加2.5枚，56周产蛋总数增加4.4枚。单倍型分析发现，单倍型TA与单倍型CG相比，中期产蛋量多1.5枚，后期产蛋量多2.5枚，56周总产蛋量多4.4枚。由此可以看出单倍型加性效应与-579位点的加性效应相同，进一步可以推测单倍型效应可能主要是-579位点的作用，-593位点的效应是连锁作用的结果。

4结论

寿光鸡GPR147基因5′调控区-593和-579位点的多态性对产蛋数有影响，单倍型TA个体拥有相对较高的中期产蛋数、后期产蛋数、300天产蛋量以及56周总产蛋量。因此，单倍型TA是具有潜在应用价值的分子遗传标记，可为寿光鸡产蛋性状的标记辅助选择提供依据。

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(编辑郭云雁)

Association of Polymorphisms in the 5′ Regulatory Region ofGPR147 with Laying Performance in Shouguang Chickens

JIA Mei-ting，LI Xian-yao，KANG Li，JIANG Yun-liang，FAN Xin-zhong，TANG Hui*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

Key words:chicken；laying traits；GPR147 gene；polymorphism

Abstract:To investigate the single nucleotide polymorphisms (SNPs) ofGPR147 gene and the correlations between SNPs and laying traits，the SNPs in the 5′ regulatory region ofGPR147 of Shouguang chicken were detected by direct sequencing method and their associations with laying traits of Shouguang chickens were analyzed.The results showed that there were 11 SNPs loci in the 5′ regulatory region ofGPR147 gene detected in the population.The -593 and -579 loci had significant effects on egg production from 45- to 56-week-old and total egg number until 56-week-old (P<0.05).Genotype TT at the -593 locus and AA at -579 locus were associated with higher egg production.Haplotype analysis of the 2 loci showed that hens with haplotype TA laid 1.5，2.5，1.6 and 4.4 eggs more than that with haplotype CG during 26-44 weeks of age (P=0.041 8)，45-56 weeks of age (P=0.032 6)，the period until 300 days of age (P=0.1) and the total period until 56 weeks of age (P=0.014 4)，respectively.In summary，the 5′ regulatory region of theGPR147 has highly polymorphic，SNPs and haplotypes at -593 and -579 loci have significant impacts on the egg number of Shouguang chickens，and they can be used as potential and valuable candidate molecular markers.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.005

收稿日期：2015-01-21

基金项目：山东省现代农业产业技术体系项目(SDAIT-13-011-02)

作者简介：贾美婷(1989-)，女，山东济宁人，硕士生，主要从事动物遗传与育种研究，E-mail：jiameiting2008@163.com *通信作者：唐辉，副教授，硕士生导师，E-mail：tanghui@sdau.edu.cn

中图分类号：S813.2

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0034-07