进口奶牛十二指肠贾第虫感染情况及其多位点基因序列研究

王臣荣，张振杰，李俊强，余复昌，曹建科，张龙现

(河南农业大学牧医工程学院，河南省人兽共患病国际联合实验室，郑州 450002)



进口奶牛十二指肠贾第虫感染情况及其多位点基因序列研究

王臣荣，张振杰，李俊强，余复昌，曹建科，张龙现*

(河南农业大学牧医工程学院，河南省人兽共患病国际联合实验室，郑州 450002)

摘要：为了解进口奶牛十二指肠贾第虫感染情况及其集聚体和基因亚型分布特征，作者基于SSU rRNA、tpi、gdh和bg基因位点对奶牛十二指肠贾第虫进行PCR检测。结果如下：基于SSU rRNA基因位点进行PCR检测，奶牛十二指肠贾第虫感染率为9.5%(48/507)，48份阳性样品均为十二指肠贾第虫集聚体E；断奶后犊牛感染率最高(20.70%)，不同年龄段奶牛十二指肠贾第虫感染率统计学差异极显著 (P<0.01)。基于tpi、gdh和bg基因位点分别扩增出48份阳性样品中19、28和34个，1份在tpi基因位点呈集聚体A和E混合感染。多位点基因序列分析和种系进化树分析结果显示，该场进口奶牛应为引进后感染十二指肠贾第虫。研究表明进口成年奶牛不易携带人兽共患十二指肠贾第虫，引种场奶牛传播人兽共患十二指肠贾第虫风险较低。

关键词：十二指肠贾第虫；集聚体；基因亚型；奶牛

十二指肠贾第虫(Giardiaduodenalis)可感染包括人在内的多种脊椎动物，被世界卫生组织(WHO)列为重要的人兽共患寄生虫之一[1]。在亚洲、非洲和拉丁美洲约有2亿人感染十二指肠贾第虫，且每年新增约50万有腹泻、呕吐等临床症状的贾第虫病患者[2]。成年奶牛感染十二指肠贾第虫后多无临床症状，犊牛感染十二指肠贾第虫后可出现腹泻、吸收不良和体重减轻等症状[3]。贾第虫病生活史简单，主要通过“粪-口”途径或直接摄入被污染的食物或水途径进行传播，流行病学研究表明，奶牛是人类感染十二指肠贾第虫的重要传染源[4]。

基于分子生物学研究，十二指肠贾第虫是一个复杂的集合体，已鉴定8个(A-H)集聚体，其中集聚体A和B为人兽共患集聚体，集聚体E主要感染偶蹄类动物[1]。近年来，包括人在内的多种动物体内均发现了集聚体E感染，提示该集聚体存在人兽共患性[1，5]。在比利时、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚、葡萄牙等国家，奶牛以集聚体E为优势感染集聚体；相比之下，在意大利、加拿大和新西兰等少数国家报道奶牛以集聚体A和B为优势集聚体[6]。国内在河南省和黑龙江省进行的调查发现奶牛可感染集聚体A、B和E，存在人兽共患风险[6-7]。目前，我国已成为世界上最大奶牛进口国，然而有关进口奶牛携带十二指肠贾第虫情况及其集聚体分布特征尚未见报道。本研究对某场自澳大利亚新引奶牛进行十二指肠贾第虫分子流行病学调查，采用多位点序列分型方法进行基因亚型鉴定，并比较引进地奶牛十二指肠贾第虫集聚体分布特征，以解析十二指肠贾第虫的遗传稳定性及其生物安全影响。

1材料与方法

1.1样品采集

调查样品来自河南省某规模化进口奶牛场，该场于2013年4月20日从澳大利亚引进1 000头荷斯坦成年奶牛(除此之外无其他奶牛)，采用人工授精方式进行配种繁育。2014年6月至2014年12月对该场随机经直肠采集507头奶牛新鲜粪便样品，每份10～30 g，装入洁净自封袋中，记录信息，带回实验室，置4 ℃保存。奶牛年龄划分参照中华人民共和国农业部《奶牛标准化规模养殖生产技术规范(试行)》，60 d以下为断奶前犊牛，61～180 d为断奶后犊牛，181～450 d为育成牛，450 d以上为成年牛。

1.2DNA提取

每份粪便样品取约200 mg，用美国OMEGA Bio-Tek公司生产的粪便DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.®Stool DNA Kit，D4015-02)，购于郑州科贸生物技术有限公司，按说明书步骤操作，提取的DNA置-20 ℃保存。

1.3PCR扩增

基于小亚单位rRNA (SSU rRNA)基因对所有样品进行贾第虫检测，引物及反应程序参照A.J.Appelbee等[8]的方法，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应体系：2 μL DNA (第2轮模板为第1轮PCR产物)，0.4 μL上游引物(25 μmol·L-1)，0.4 μL上游引物(25 μmol·L-1)，4 μL dNTPs (2.5 mmol·L-1)，12.5 μL 2×GC buffer II，0.25 μL LA rTaq 酶(5 U·μL-1)，加蒸馏水至25 μL。基于SSU rRNA基因鉴定出的阳性样品，用磷酸丙糖异构酶(tpi)、谷氨酸脱氢酶(gdh)和β-贾第素(bg)位点进行基因亚型鉴定，引物及反应程序分别参照I.M.Sulaiman等[9]、S.M.Cacciò等[10]和M.Lalle等[11]的方法。反应体系：2 μL DNA，0.4 μL上游引物(25 μmol·L-1)，0.4 μL上游引物(25 μmol·L-1)，2 μL dNTPs (2.5 mmol·L-1)，2.5 μL 10 × Taq buffer，0.2 μL rTaq 酶(5 U·μL-1)，加蒸馏水至25 μL。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，置紫外凝胶成像仪内观察并拍照。

1.4测序

PCR产物测序委托北京诺赛基因有限公司完成，采用双脱氧终止法进行双向测序，测序仪为ABI PRISMTM 3730 XL DNA Analyzer (Applied Biosystems，USA)。

1.5集聚体和基因亚型鉴定

序列经拼接后，在GenBank上用Blast进行同源序列搜索，下载相应的参考序列应用Clustal X V2.0进行比对分析进而确定十二指肠贾第虫集聚体的类型、基因亚型及不同序列间的碱基差异。

1.6种系发育分析

应用MEGA 6 (http：//www.megasoftware.net/) 软件进行序列比对，在GenBank上用Blast进行同源序列搜索，采用邻接法构建种系进化树，用bootstrap对进化树进行可靠性分析，1 000个重复。

1.7统计学分析

采用χ2检验比较不同年龄段牛十二指肠贾第虫感染率差异，P<0.05时为统计学差异显著。

2结果

2.1十二指肠贾第虫感染情况

基于SSU rRNA基因位点，奶牛粪便样品中十二指肠贾第虫感染率为9.5% (48/507)，其部分电泳结果见图1。断奶前犊牛、断奶后犊牛和育成牛感染率分别为10.3% (17/165)、和20.7% (28/135)和2.9% (3/105)，成年牛未见感染。不同年龄段奶牛十二指肠贾第虫感染率统计学差异极显著(P<0.01)。

2.2集聚体和基因亚型鉴定

48条SSU rRNA序列经比对鉴定，均为集聚体E。基于tpi、gdh和bg基因位点，对48份阳性样品进行PCR扩增，分别扩增出19、28和34个。其中1份呈混合感染，在SSU rRNA基因位点鉴定为集聚体E，而在tpi基因位点为集聚体A。

基于tpi基因位点，18条集聚体E序列形成8个基因亚型，命名为E1～E8。E1 (n=7)是最主要的基因亚型，其序列与孟加拉奶牛源十二指肠贾第虫分离株集聚体E序列一致(GenBank：KJ363351)；E2 (n=5) 序列与河南奶牛源(KF843945)、绵羊源(KP635102)和黑龙江奶牛源(JN162349)十二指肠贾第虫分离株集聚体E序列一致；E8 (n=1) 序列与河南绵羊源(KP635101)和黑龙江绵羊源(JQ928713)十二指肠贾第虫分离株集聚体E序列一致；E3 (n=1) 序列与河南绵羊源(KP635105)和澳大利亚绵羊源(GQ444457)十二指肠贾第虫分离株集聚体E序列相比，分别有4和5个碱基的差异；E4 (n=1) 序列与吉林奶牛源(KM434077) 十二指肠贾第虫分离株集聚体E序列有1个碱基差异，E5 (n=1) 序列与斯里兰卡牛源(KF891310) 十二指肠贾第虫分离株集聚体E序列有2个碱基差异，E6 (n=1) 序列与澳大利亚绵羊源(GQ444456) 十二指肠贾第虫分离株集聚体E序列有1个碱基差异，E7(n=1) 序列与澳大利亚绵羊源(GQ444457)十二指肠贾第虫分离株集聚体E序列有2个碱基差异。E1 (n=7)、E2 (n=5)、E3 (n=1)、E4 (n=1)、E5 (n=1)、E6 (n=1)、 E7(n=1)和E8 (n=1)分别和澳大利亚牛源(KF019197)十二指肠贾第虫分离株集聚体E序列分别有4、3、6、3、5、5、3和3个碱基差异，见表1。本研究鉴定出的十二指肠贾第虫集聚体A序列与河南牛源(KF843947)、澳大利亚牛源(GQ444447) 十二指肠贾第虫分离株集聚体A序列一致。

基于gdh基因位点，28条集聚体E序列形成7个基因亚型，分别命名为E1～E7。E1 (n=17)是最主要的基因亚型，其序列与河南奶牛源(KF843925)、澳大利亚牛源(AY178740)十二指肠贾第虫分离株集聚体E序列一致；E2 (n=1)序列与河南奶牛源(KF843924)+二指肠贾第虫分离株集聚体E序列一致； E3 (n=6)序列河南奶牛源(KF843923) 十二指肠贾第虫分离株集聚体E序列一致；E4 (n=1)、E5 (n=1)、E6 (n=1)和E7 (n=1)序列分别与河南奶牛源(KF843925)十二指肠贾第虫分离株集聚体E序列有1、1、2和2个碱基差异，见表1。

基于bg基因位点，34条集聚体E序列形成7个基因亚型，分别命名为E1～E7。E1 (n=18)是最主要的基因亚型，其序列与河南绵羊源(KP635114)十二指肠贾第虫分离株集聚体E序列一致；E2 (n=5)、E3 (n=6)、 E4 (n=1)、E5 (n=2)、E6 (n=1)和E7 (n=1)序列分别与上述序列有2、1、1、1、3和2个碱基差异，见表1。

2.3种系发育分析

基于tpi基因序列建立种系发育系统进化树，分为两个系群，集聚体A和集聚体E，见图2。如图所示，确定分离到的集聚体A1亚型属AI亚群。优势基因亚型E1和E2与孟加拉奶牛源、河南省奶牛源和绵羊源十二指肠贾第虫序列在一个进化支上，形成一个亚群；E3和E6各形成一个亚群；E4和E8与河南奶牛源、吉林奶牛源和黑龙江绵羊源十二指肠贾第虫序列形成一个亚群；E5与吉林奶牛源和斯里兰卡牛源十二指肠贾第虫序列形成一个亚群；E7与澳大利亚绵羊源和澳大利亚牛源十二指肠贾第虫序列形成一个亚群。在gdh和bg基因位点，十二指肠贾第虫核酸序列变异较小，未作种系发育分析。

表1十二指肠贾第虫集聚体E在gdh、tpi和bg位点的核苷酸序列变异

Table 1Mutations in thegdh，tpiandbggenes amongG.duodenalisassemblage E isolates from cattle

碱基位置标号分别以参考序列KJ363351、KF843925和KP635114来确定，碱基位置1表示参考序列第1个核酸；“-”表示碱基相同

The sequence of KJ363351，KF843925 and KP635114 is regarded as reference sequence respectively，for example，the number one of base positions is the first nucleic acid；“-” represent the same as reference sequence

3讨论

贾第虫的流行病学调查常采用的标记基因有SSU rRNA、tpi、gdh、bg和延伸因子1-α (el1-α)等，其中tpi基因序列多态性变异较大，广泛用于贾第虫集聚体和基因亚型的分类研究[12]。本次调查，河南省某规模化场进口奶牛十二指肠贾第虫感染率为9.5%，略高于河南省(7.2%，128/1 777)、黑龙江省(6.4%，41/643)和宁夏回族自治区(2.12%，29/1 366)奶牛的感染率[6-7，13]。J.Ng等[14]报道澳大利亚西部和新南威尔士州小于4月龄犊牛十二指肠贾第虫总感染率为26.9%(98/364)，而K.A.Becher等[15]报道澳大利亚西部犊牛感染率高达89% (48/54)。感染率差异往往受多种因素影响，如样本采集量、检测方法、地理环境、不同的管理方式和季节等。此次调查采用PCR方法检测，奶牛十二指肠贾第虫感染率高于国内采用显微镜检测法的报道[6，16-17]，低于澳大利亚采用PCR方法检测的报道，表明不同检测方法和不同地域奶牛十二指肠贾第虫感染率存在差异。

资料显示，不同年龄段奶牛十二指肠贾第虫感染率存在着较大差异。R.M.O’Handley等[18]报道澳大利亚2～3月龄断奶后犊牛十二指肠贾第虫感染率最高为16%，而M.P.Mark-Carew等[19]调查发现纽约市31～60日龄断奶前犊牛感染率较高，为2.5%。本研究发现断奶后犊牛十二指肠贾第虫感染率最高，成年牛未发现十二指肠贾第虫感染，与R.M.O’Handley等[18]报道相一致，而与国内河南省断奶前犊牛十二指肠贾第虫感染率(22.7%)和黑龙江省调查发现断奶前犊牛十二指肠贾第虫感染率(16.1%，22/131)最高存在差异[6-7]。分析其原因，可能与管理方法、动物健康状态和饲喂环境等因素相关。

在东北地区的研究显示，奶牛主要感染十二指肠贾第虫集聚体E[12]；河南省奶牛除了感染集聚体E，人兽共患集聚体A亦常见[6]；而在黑龙江省则发现奶牛更常见感染人兽共患集聚体B，集聚体E次之[7]。在澳大利亚的调查显示，奶牛最常见感染十二指肠贾第虫集聚体E，偶见人兽共患集聚体A和集聚体B[14-15，18]。本研究基于SSU rRNA基因位点检测到48份十二指肠贾第虫均为集聚体E，基于tpi基因位点鉴定1份为集聚体E和A混合感染，表明该场奶牛感染的十二指肠贾第虫人兽共患风险较低。

本研究基于多位点序列分析和种系进化树分析，该场奶牛所感染的十二指肠贾第虫主要基因亚型与澳大利亚牛源和绵羊源基因亚型差异较大，与河南省当地奶牛源和绵羊源基因亚型序列差异较小，提示进口奶牛应为引进后感染十二指肠贾第虫。此外，十二指肠贾第虫常呈混合感染，应采用不同基因位点同时进行鉴定，以确定其基因型及序列多态性。

4结论

不同检测方法和不同地域奶牛十二指肠贾第虫感染率存在差异，所检测进口成年奶牛不易携带人兽共患十二指肠贾第虫，引种场奶牛传播人兽共患十二指肠贾第虫风险较低。

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(编辑白永平)

The Investigation of Infection and Multilocus Sequence ofGiardiaduodenalisin Dairy Cattle from an Imported Farm

WANG Chen-rong，ZHANG Zhen-jie，LI Jun-qiang，YU Fu-chang，CAO Jian-ke，ZHANG Long-xian*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，InternationalJointResearchLaboratoryforZoonoticDiseasesofHenanProvince，Zhengzhou450002，China)

Key words:Giardiaduodenalis；assemble；genotypes；dairy cattle

Abstract:We investigated the infection ofGiardiaduodenalisin dairy cattle from an imported farm，and then we analyzed the distribution of the genotypes and assemblage ofG.duodenalis.The detection ofG.duodenalisin dairy cattle base on the locus of SSU rRNA，tpi，gdhandbgby PCR. Results indicated that the prevalence ofG.duodenalisin dairy cattle is 9.8% (48/507) based on SSU rRNA by PCR，and 48 positive samples were identified assemblage E.The prevalence ofG.duodenalisin post-weaning calves was the highest (20.70%)，the difference of the prevalence ofG.duodenalisin cattle in different ages was significant.The 48 positive samples were amplified 19，28 and 34 base ontpi，gdhandbglocus respectively，one sample was mixed infection (assemblage A and assemblage E).Multilocus sequence and phylogenetic analysis indicated thatG.duodenalisinfecting dairy cattle from an imported farm may be from the local area. The results indicate that imported adult dairy cattle is not ease to carry ZoonoticG.duodenalis，dairy cattle from an imported farm have a lower risk to transmite ZoonoticG.duodenalis.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.022

收稿日期：2015-06-20

基金项目：十二五国家重大科技专项课题(2012ZX10004220)；河南省科技创新杰出人才计划(134200510012)；河南省高校科研创新团队项目(012IRTSTHN005)

作者简介：王臣荣(1985-)，男，河南南阳人，硕士生，主要从事人兽共患寄生虫学研究，E-mail：1203431811@qq.com *通信作者：张龙现，教授，E-mail：zhanglx8999@henau.edu.cn

中图分类号：S855.99

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0165-07