DMT1:多种二价金属离子的转运载体

唐家明，邹亚学，王秋悦，吕 林，张丽阳，罗绪刚*，李素芬*

（1.河北科技师范学院，河北 秦皇岛 066004；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100093）

DMT1:多种二价金属离子的转运载体

唐家明1，邹亚学1，王秋悦1，吕 林2，张丽阳2，罗绪刚2*，李素芬1*

（1.河北科技师范学院，河北 秦皇岛 066004；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100093）

二价金属离子转运蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）是一种在哺乳动物广泛表达的金属离子转运载体，参与机体内多种金属离子的转运。本文综述DMT1分子结构与分布、生理功能及其对二价金属离子吸收的调控机制，旨在通过对DMT1在微量元素吸收中的作用机制的研究，来提高动物微量元素的吸收效率和利用率。

DMT1；二价金属离子转运蛋白

二价金属离子转运蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）又称为自然抵抗相关巨噬蛋白2（natural resisitance associated macrophage protein 2，Nramp2），或二价阳离子转运载体1（divalent cation transporter 1，DCT1），属于可溶性载体家族成员（solute carrier family 11 member 2，SLC11A2），是哺乳动物体内质子偶联的跨膜金属离子转运载体。1995年，Gruenheid等在筛选小鼠天然抗性的巨噬细胞蛋白1 （Nramp1）时，首次发现了与Nramp1同源的Nramp2。1997年，Fleming和Gunshin两位科学家几乎同时发现DMT1是哺乳动物第一个跨膜铁转运蛋白。当它被首次发现时,由于与已经发现的Nramp1基因同源性高达78%，因此被命名为Nramp2。从DMT1发现以来，关于它的结构、功能、表达等方面已经获得很多重要发现，对于DMT1的研究已经成为铁乃至整个微量元素研究领域的一个热点问题。

1 DMT1的分子结构和分布

1.1 DMT1的分子结构 Gruenheid等（1995）在研究具有天然抗性的巨噬细胞蛋白 1（nature resistance-associated macrophage protein 1，Nramp1）的过程中发现另一种与Nrampl有极高同源性（达78%）和相似的二级结构的蛋白质（DMT1）。1997年哈佛大学和耶鲁大学的两个研究小组分别鉴别分离出功能基因DMT1，这是迄今为止所克隆的第一个哺乳动物跨膜铁转运载体。生物信息学可知DMT1的结构和Nramp1相似，DMT1分子量为61456，等电点为6.02，含有12个跨膜结构域，在第7和8跨膜结构域之间的天门冬氨酸残基是一个糖基化位点，其糖基化的细胞外袢状结构和高度保守的细胞内序列都具有高度的疏水性。DMT1的第4跨膜结构域是一个重要的功能区，若此域发生突变将会严重影响DMTl功能的正常发挥。DMT1基因组DNA含有43999个碱基，包括16个外显子，其cDNA有4142个碱基,所编码蛋白含561个氨基酸，其羧基端和氨基端均位于细胞胞质内。DMT1与同家族Nramp1的基因同源性高达78%,氨基酸相似性达到64%，二者的主要区别在于氨基端的不同。DMT1有高度的疏水性,它的氨基端和羧基端都嵌入胞浆内。Andrews等研究发现DMT1的mRNA存在“+IRE”和“-IRE”型2种形式。“+IRE”型的3’非翻译区含有1个与运铁蛋白受体（TfR）mRNA的3’非翻译区相似的铁调节元件（iron regulatory element，IRE），“-IRE”型则没有此元件。“+IRE”和“-IRE”分别编码561个和568个氨基酸，其中N-端543个氨基酸相同，只有C-端18或25个氨基酸不同。DMT1 mRNA的5’调控区无TATA盒子，但包含2个CCAAT盒子，3个SP1的结合位点，5个金属反应元件（metalresponse element，MRE），2个Hif结合位点和1个γ-干扰素调节元件。

1.2 DMT1的体内分布 DMT1在哺乳动物各组织中广泛表达，尤其在十二指肠和肾的表达最高，在胸腺和脑有中等程度的表达，而在睾丸、肝、结肠、心脏、脾、骨骼肌、肺、骨髓的含量相对较低。DMT1在小肠上皮细胞中的表达主要定位在肠细胞绒毛膜刷状缘上，但Trinder等（2000）通过共聚焦免疫荧光显微镜观察小肠绒毛细胞发现，不仅在细胞膜上有DMT1定位，在绒毛顶端胞浆中也可观察到DMT1表达，提示DMT1可能在这些位点之间循环转运。DMT1在肾脏中主要存在于肾脏皮质，且从近端小管和集合管发散出，存在位置既不是顶膜，也不是基底外侧膜，而是晚期胞内体和溶酶体内。

2 DMT1的生理功能

2.1 DMT1介导小肠铁吸收和转运 铁在小肠的吸收包括两个转运过程，即粘膜吸收过程（铁吸收进入肠上皮细胞）和粘膜转运过程（铁从肠上皮细胞的基底侧转运到血液循环），其中粘膜吸收过程是机体维持铁平衡的最关键一步。Fleming等研究发现肠腔内铁主要是以二价形式经小肠上皮顶膜上的DMT1介导由肠腔进入上皮细胞内，然后再经基底膜铁转运蛋白1（Ferroprtin1，FPN1）介导由肠细胞进入血液循环。DMT1介导的二价铁离子的转运是H+依赖的主动转运过程。在患有严重缺铁性贫血小鼠和Begeade大鼠都存在相同的DMT1基因G185R位点突变，表明DMT1表达障碍严重影响小肠铁吸收，导致铁缺乏性小细胞、低色素性贫血。

运铁蛋白（Transferrin，Tf）和运铁蛋白受体（Transferrin receiptor，TfR）途径是细胞摄取铁的主要生理途径。在这一过程中，内吞小体酸化使三价铁从Tf上释放并变为二价铁。然后，二价铁穿过内吞小体膜进入胞浆。Begrade大鼠能够正常地通过Tf和TfR将铁吸收，并在细胞内形成内吞小体，但随后内吞小体内的铁却无法转运入胞浆。最终内吞小体的铁又全部返回到细胞表面，释放回血液中。研究也已证实，DMT1 与TfR在内吞小体上共同存在。DMT1在铁“移位”中的重要作用，证明Tf-TfR不依赖的铁转运机制是细胞生理铁摄取所必需的。正是Tf-TfR依赖的和Tf-TfR不依赖的铁转运机制共同作用，才能最终完成细胞生理铁摄取的全过程。

2.2 DMT1介导其他金属离子转运 DMT1能够转运的金属离子达8种之多，除了Fe2+以外，还可以转运Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Cd2+和Pb2+。研究表明，DMT1与转运金属的亲和力顺序为Mn2+＞Cd2+＞Fe2+＞Pb2+～Co2+～Ni2+＞Zn2+。DMT1是动物肠道中发现的唯一二价锰转运载体，在哺乳动物肠道锰的吸收过程中起重要作用，从胃部排出的可溶性二价锰，通过肠微绒毛DMT1的转运才能被机体吸收。已经证实，DMT1参与大鼠、猪和鸡肠上皮细胞对锰的摄取。DMT1突变Belgrade大鼠细胞摄取锰的能力也降低。

DMT1是否参与铜的转运还不清楚。用Coca-2细胞模型研究表明，在小肠细胞中DMT1的生理功能与Cu1+的转运有关，且铁和铜在小肠中的吸收存在拮抗关系。DMT1 IRE亚基可以转运铜，但是以Cu+的形式被转运。Espinoza等采用shRNA技术使DMT1蛋白表达沉默后，Caco-2细胞摄取和转运铁、铜和锌的量分别减少51%、25.8%和23.1%，说明DMT1不同程度地参与铁、铜和锌的转运。研究也发现DMT1 的-IRE亚基能够转运Ni2+，DMT1转运Cd2+可能与镉的毒性有关。Cd2+和Mn2+能抑制铁的运输，Zn2+和Pb2+却不能，这为DMT1在Caco-2细胞直接参与摄取铁和镉提供了证据，其结果解释了铁缺乏是镉中毒的危险因素。pH依赖的Co2+运输也已经被证明，但是其生理学意义尚不清楚。

3 DMT1的二价金属离子吸收依赖调控机制

3.1 Fe对DMT1表达的影响 DMT1是十二指肠转运铁的主要载体，并受到体内铁状况的调控。Dupic等报道，断奶大鼠饲喂无铁饲粮或添加2%羧酸铁的高铁饲粮2周，无铁饲粮组十二指肠中与铁吸收转运相关基因Dcytb、DMT1、FPN1 和TfR1的mRNA水平均提高，而高铁饲粮组上述基因mRNA水平则明显降低。Hansen等在21日龄断奶仔猪脱脂奶粉-酪蛋白-玉米半纯合饲粮中以硫酸亚铁形式添加100 或500mg/kg铁饲喂32d后，加铁组十二指肠粘膜DMT1 mRNA水平随铁水平降低而降低，DMT1和FPN1蛋白水平也有降低的趋势；在21日龄断奶仔猪含铁97mg/kg玉米-豆粕-乳清粉饲粮中以硫酸亚铁形式添加700mg/kg铁，饲喂21、42或63d后，尽管基因表达水平在不同日龄有变化，加铁组十二指肠粘膜DMT1 mRNA水平仅为不加铁组10%。Tako等在肉鸡饲粮中以硫酸亚铁形式添加100mg/kg铁，十二指肠中DMT1 mRNA水平降低。但Hansen等在8周龄断奶犊牛饲粮中以硫酸亚铁形式添加750mg/kg铁饲喂56d后，发现高铁组十二指肠粘膜DMT1 mRNA和蛋白都表现出降低趋势。

铁调控DMT1表达的机制可能与DMT1 mRNA稳定性增加有关。DMT1 mRNA3’非翻译区的IRE可以像TfR一样受铁调控蛋白（iron regulatory protein，IRP）的调控。当机体铁缺乏时，IRP紧密地与DMT1 mRNA3’非翻译区IRE结合，DMT1 mRNA稳定性增加，DMT1 mRNA水平增加，蛋白表达量也增加，高铁状态时正好相反。不同组织中“+IRE”与“-IRE”型所占的比例不同，脑和肠道中“+IRE”型比例高，而脾、胸腺和胰脏中“-IRE”型比例高。“-IRE”型mRNA的稳定性是否也受铁调控还不清楚，但有证据表明，缺铁动物的小肠、脑等组织发现DMT1 mRNA和蛋白表达量增加。这些都支持“+IRE”型的DMT1表达可能是受IRP/IRE介导的转录后调控的观点。Arredondo等最近的研究发现，铁对DMT1表达的调控可能通过5’端外显子1和含有IRE的3’外显子两个区域进行。

3.2 Mn对DMT1的表达影响 Bai等报道，在55周龄临界缺锰蛋鸡饲粮中添加300mg/kg锰，饲喂12周后，加锰组十二指肠、心脏和肝脏中DMT1 mRNA水平明显降低；用肉鸡结扎十二指肠段灌注锰，也发现肠粘膜中DMT1 mRNA水平降低。Li等报道，体外培养Caco-2细胞培养液中加入锰800μmol/L，DMT1 mRNA表达水平降低，但Wang等在脉络膜上皮细胞培养基中加入锰100或 200μmol/L，却上调了DMT1 mRNA表达。造成这种差异的原因，可能与锰添加水平不同有关。

3.3 其他金属离子对DMT1表达的影响 哺乳动物后期幼鼠膳食高锌时DMT1 mRNA水平显著降低，表达量约为缺锌或适锌组的1/3～1/4。Sachie等发现，锌上调Caco-2中DMT1蛋白和mRNA表达量。Caco-2细胞暴露于含锌50、100和200mol/L环境24h后，细胞中DMT1 mRNA表达量分别比对照组上调了32%、79%和134%。上述结果提示，补锌后小肠细胞对铁的摄取增加。

Caco-2对铜的摄取与细胞内铁含量成负相关，去铁铵处理细胞对铜的摄取量增加，而高铜处理则降低DMT1 mRNA及蛋白表达量。但在肉牛的小肠研究中添加和不添加铜对小肠中DMT1两种亚型mRNA表达量没有明显影响，对DMT1蛋白表达量也没有明显影响，提示铜是被DMT1转运的，但转运方式为Cu1+，并且转运量很小。

3.4 非金属离子对DMT1表达的影响 徐君等发现大豆球蛋白与β-伴球蛋白对小鼠肠上皮细胞DMT1基因的表达有抑制作用。由于抗原蛋白引起上皮细胞过敏反应，炎性细胞因子的增加，细胞内代谢发生紊乱，DMT1的基因转录所需要的物质比正常情况下降低，也在一定程度上影响了DMT1的基因表达,从而影响了二价金属离子的吸收。DMT1基因表达的调控因素还有很多，炎症因子、脂多糖、TNF-α、INF-γ、蛋白激酶C和发育阶段等因素均参与其调控。

4 今后的研究方向

4.1 现在的研究水平多见与在mRNA水平的研究，而机体直接起作用是在蛋白水平，DMT1蛋白水平研究是大势所趋。

4.2 目前对DMT1的研究，大多是体外实验，体外模拟体内环境实验与体内真实环境有很大差距。因此，应加强体内试验研究。

4.3 应进一步深入研究DMT1在多种金属元素转运过程中的作用机制及其信号传导途径。

4.4 DMT1在小肠中是否也参与有机金属元素的转运。

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10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．07.004

国家自然科学基金（31272465）

唐家明，硕士研究生，从事动物营养生理研究。

★通讯作者：罗绪刚，研究员，博士生导师，从事家禽矿物元素营养与分子生物学研究。

★通讯作者：：李素芬，教授，硕士生导师，从事动物营养生理研究