循环肿瘤细胞在非小细胞肺癌诊疗中的应用进展

干争光综述，罗　以审校（.南华大学，湖南衡阳4200；2.湖南省肿瘤医院老干头颈内科，长沙40005）

循环肿瘤细胞在非小细胞肺癌诊疗中的应用进展

干争光1综述，罗以2△审校
（1.南华大学，湖南衡阳421001；2.湖南省肿瘤医院老干头颈内科，长沙410005）

肺肿瘤；癌，非小细胞肺；血液循环；综述

肺癌的发病率逐年升高，发病率及病死率均居于恶性肿瘤首位，非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的85%左右［1］。因肺癌早期症状不明显，发现时多已晚期，5年生存率仅15%［2］。因此，亟待一种行之有效的方法来提高早期诊断率、预测转移和复发，并实时监测疗效，以提高总体治愈水平。众所周知，恶性肿瘤的一个重要特征是复发和转移。循环肿瘤细胞（CTCs）与肿瘤远处转移关系密切，在肿瘤转移的环节中有极其重要的作用。因此，对肺癌患者检测CTCs具有重要价值。本文对NSCLC诊疗中CTCs的应用作如下综述。

1　CTCs概述

1869年，Thomas Ashwoah首次提出CTCs的概念［3］。目前，人们将CTCs定义来源于实体瘤本身或转移灶肿瘤细胞，通过不同途径释放进入血液循环，自发产生或诊疗操作所致［4］。来源于恶性肿瘤原发部位的肿瘤细胞，通过细胞周期不断增殖、上皮间质转化（EMT）［5］，发生一系列分子表型改变，极具侵袭性，从而容易进入循环系统，CTCs聚集成团形成微小癌栓，定植于不同的组织器官中，在一定条件下发展为转移灶。CTCs具有以下特点：（1）CTCs数量少，机体免疫机制等因素使得进入血液循环中的CTCs被大量吞噬、灭活；105～107个外周血单核细胞大约仅存在一个CTC［6］，在疾病的早期阶段甚至更低。（2）CTCs源于实体肿瘤，肿瘤具有异质性的特点：①遗传上具有异质性，CTCs虽然与原发肿瘤具有基因组同源性，但与肿瘤原发部位细胞存在着异质性；②CTCs在标记基因的表达上存在差异，因EMT等原因的存在，使CTCs在不同程度上具有间质细胞和上皮细胞2种细胞的特征；③CTCs在形态学上具有差异性，CTCs属于肿瘤细胞，肿瘤细胞具有形态上的异质性。（3）因细胞亲和力的存在，多个CTCs有聚集成团的倾向，容易形成循环肿瘤微栓（CTM），这多见于 NSCLC［7］。因为CTCs具有上述特点，导致了检测CTCs存在较大困难，CTCs的研究进展缓慢。伴随着检测技术的进步及人们对CTCs了解的不断加深，CTCs逐渐成为研究热点。

2　CTCs的检测方法

CTCs罕见于肿瘤患者外周血液中，检测要求敏感性极高、精确性高，能对CTCs准确定量。目前CTCs检测有较多的方法，一般以以下几种检测方法最常见。

2.1基于肿瘤免疫学原理的分离、检测方法这种方法基于抗原-抗体反应的原理，是目前检测方法使用最普遍的一种。因CTCs是来源于上皮源性原发肿瘤或其转移灶，具有上皮细胞的特征。上皮特异性细胞黏附分子（EpCAM）在上皮组织表面广泛表达，因此常被用作CTCs的检测标志。目前最常见的CellSearch系统，由美国食品药物管理署批准进入临床，用来预测转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌患者的无疾病进展生存时间（PFS）和总生存时间（OS）。在该系统的检测试剂盒中，含有一种基于铁磁流体的捕获试剂盒免疫荧光试剂，在磁芯的聚合层上涂有针对EpCAM抗原的抗体，以捕获CTCs。该检测方法具有高敏感性及高效性的特点，但因为肿瘤细胞EMT的存在，癌细胞部分丢失了上皮细胞特异性标志物（如EpCAM等），并部分具有间质细胞的特征，如表达钙黏附素等［7］，并且不是所有上皮细胞肿瘤中EpCAM都有表达（如恶性黑色素瘤），因此常存在漏检的可能，且设备昂贵，不利于广泛应用。

2.2基于细胞大小的分离、富集方法（ISET）该检测方法基于细胞物理学及形态学特性来区分肿瘤细胞，CTCs形态较正常血细胞偏大。因此，使ISET分离富集成为可能。该方法原理简单，易于操作，对设备要求不高，并可避免基于依靠EpCAM标记检出率低的缺陷，使检出率大大提高［8］。但由于借助细胞形态学进行细胞分离，因此筛选不具特异性［9］，且很大限度上依赖病理学家的经验，有一定局限性。

2.3流式细胞术（FCM）FCM是20世纪70年代发展起来的一种基于免疫学原理的方法，将肿瘤细胞特异标志与携带荧光物质的抗体进行结合标记，然后将标记的肿瘤细胞通过流式细胞仪来进行鉴定分析，可以快速测量肿瘤细胞结构的分析和分选，但FCM也存在效率及敏感性较低的不足。

2.4通过核酸来检测CTCs目前，最常用的核酸检测方法是逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。因正常的血细胞中不存在肿瘤细胞的某些基因或表达的信使RNA，因此血液中检测出这些DNA或RNA可间接提示CTCs的存在［10］。但由于mRNA易降解、受扩增效率和非特异性扩增的影响，易出现假阳性的结果。且该方法检测是用核酸来推测CTCs的存在，可能造成检测量与CTCs实际水平存在差距［11］。

3　CTCs与NSCLC

3.1CTCs与早期NSCLC诊断治疗NSCLC的诊断时期决定了治疗方法及患者的预后，早期诊断是治愈患者的关键。目前NSCLC早期诊断主要依赖于影像学检查，但对直径小于5 mm的肿块难以发现。Bevilacqua等［12］表明，通过影像学检查诊断为Ⅰ期肺癌患者，其血液中检测到了CTCs，说明肿瘤细胞的播散在疾病早期可能就已经发生。Kurusu等［13］也在早期肺癌患者中检测到了CTCs，并发现部分手术患者的局部复发和远处转移在短时间内就出现，提示远处微转移病灶可能已经存在。据统计，经手术根治治疗的Ⅰ期NSCLC患者，其5年复发转移率超过30%［14］，且多为全身性播散转移，进一步提示以影像学为基础分期的早期肺癌可能已经存在远处瘤细胞微转移的发生。从某种程度上来说，在NSCLC早期诊断中CTCs敏感性可能更高。

3.2CTCs与NSCLC的分期目前实体瘤的分期仍依据TNM分期来进行，主要包括肿块大小、区域淋巴结转移、远处转移，主要通过影像学来指导肿瘤的分期。现有研究认为，肿瘤的TNM分期与CTCs的检出具有一定相关性，CTCs数量水平与实体瘤TNM分期有较高的一致性。Kerbs等［15］选取了Ⅲ期和Ⅳ期NSCLC患者行CTCs计数，发现Ⅳ期患者CTCs数量为0～146个，明显高于ⅢB期（0～3个）和ⅢA期（0个）。陈燕等［16］研究了不同分期的NSCLC，发现CTCs数量在Ⅲ、Ⅳ期明显高于Ⅰ、Ⅱ期。目前广泛应用影像学检查显示的肿块大小，在某些情况下不能完全反映肿瘤的浸润能力。因此，CTCs在一定程度上可以弥补影像学的不足，并与影像学紧密结合以指导肿瘤分期，为患者制订切实可行的治疗方案提供依据。有研究表明，术前或者术后血液中CTCs水平较高的患者，术后的远期生存率就比较差，提示临床上一些按常规影像学数据来判定为早期肺癌患者，实际上并非为早期［13］。目前按早期肺癌患者所采取的常规治疗措施，可能严重影响早期肺癌的治疗效果及预后。因此，通过CTCs的检测，可以在某些早期肺癌术后患者中，采取术后辅助化疗或者靶向治疗，以提高疗效及远期生存率。

3.3CTCs与NSCLC的疗效评价由于肺癌患者早期无明显症状和体征，目前绝大多数NSCLC诊断明确时已处于晚期，丧失了手术治疗的机会。而化疗、放疗及分子靶向综合治疗成为主要治疗手段。目前肺癌患者疗效评价仍采用实体瘤RECIST评价标准，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）及进展（PD）。研究表明，临床上疗效评价为CR、PR的患者，外周血CTCs较化疗前下降，提示CTCs的变化与实体瘤评价存在较高的一致性，治疗期间CTCs数量的变化与治疗应答相关。李晶等［17］选取中晚期NSCLC患者分别于化疗前、2周期化疗后检测CTCs，每2个周期行疗效评估，结果提示CTCs数目评价与RECIST评价疗效比较，差异无统计学意义（P＞0.05），显示2种评价方法有较高的吻合度。Punnoose等［18］研究发现，在化疗后产生应答，PET/CT提示肿块缩小，肿瘤代谢减低，同时检测化疗前、后患者的CTCs水平，治疗有效应答的患者其CTCs水平较化疗前下降，表明CTCs检测与PET/CT相吻合，且这部分患者PFS较长。通过CTCs的变化，来明确治疗的有效性，指导治疗方案的实施，提高疗效。同时，CTCs检测具有易于操作性和可重复性的特点，具有动态性及实时性的优点。

3.4CTCs与NSCLC预后肿瘤的预后，由多种因素决定，但研究表明，患者预后与CTCs有着密切关系［19］。Hofman等［20］研究发现，在转移性NSCLC中，化疗前检测出CTCs数量多的患者，其PFS及OS均明显缩短。Hou等［21］研究发现，化疗前、后CTCs的变化对患者的PFS 及OS有较强预测作用。Hofman等［22］进一步研究表明，CTCs可以作为可手术的NSCLC预后评价指标，说明可手术治疗的NSCLC预后与术前CTCs计数相关，提示术前检测患者CTCs对预测预后有着一定的价值。Rolle等［23］发现，已手术治疗的肺癌患者，其预后也与术后CTCs数量变化相关，术后CTCs增加的患者复发风险明显增高。对肺癌患者来说，CTCs数目的增加，提示肿瘤的复发进展或转移风的上升，预示患者的预后较差。

3.5CTCs与NSCLC分子靶向治疗随着个体化治疗研究深入，肺癌治疗进入了基于肿瘤分子标志物指导下的化疗、靶向综合治疗的新时代。表皮生长因子受体（EGFR）成为目前研究的热点，但是部分患者不易获得组织标本，从而使EGFR检测受到一定的限制。CTCs的存在，为这些患者行相关基因检测，提供了另外一条可能途径，就是从这些患者的CTCs中提取相关基因，来检测是否存在基因突变，再根据基因突变的情况，来指导进一步的治疗。Kimura等［24］使用扩增阻滞突变系统方法提取患者血清中的DNA，并检测了EGFR突变情况，提示与原发组织中EGFR突变之间存在较高的一致性（72.7%），说明血清DNA检测EGFR突变具有可操作性，为进一步使用CTCs检测基因突变成为可能。Maheswaran等［25］选择了12例存在EGFR突变的NSCLC，检测CTCs所携带的EGFR情况，结果显示有11例同样存在EGFR基因突变，与组织中EGFR突变有着很高的一致性。研究表明，在靶向治疗的过程中，基因的突变或者表达可能发生改变产生继发性耐药，例如对酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）有良好治疗反应的NSCLC患者，在治疗开始后的10～12个月内，对TKIs制剂（如吉非替尼）不再有效，其中EGFR20号外显子突变（T790M）的存在是EGFR-TKIs耐药主要原因之一［25］。Sequist等［26］研究发现，在对EGFR-TKIs耐药的患者中，同样存在CTCs的T790M突变，提示CTCs的基因突变与原发组织存在高度的一致性，并证明了T790M突变明显降低了患者PFS。Gasch等［27］同样证实在CTCs表面存在EGFR突变，并进一步证实CTCs标记的EGFR与患者原发病灶之间存在异质性。这说明了EGFR-TKIs制剂对不同患者存在疗效差异的原因，也是表面分子靶向治疗存在原发耐药的原因之一。Pailler等［28］选取了18例存在间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因重排的NSCLC，研究者提取CTCs 的ALK基因检测，显示ALK基因重排同样存在，从而可以指导ALK抑制剂克唑替尼在NSCLC的治疗。Ilie等［29］对NSCLC中ALK基因重排的研究中，也得到了同样的结论。随着基因个体治疗研究的不断深入，肺癌中越来越多的靶基因被发现，它们为肺癌的分子靶向治疗提供更加广阔的前景，同样，这些生物标记也可以从肺癌CTCs提取出来，来对个体化治疗进行优化。研究表明，核苷酸切除修复交叉互补组1（ERCC1）在NSCLC中存在，其表达水平高的患者，对铂类药物化疗反应差，表达水平低的患者，含铂方案化疗疗效较好；进一步研究提示，ERCC1的表达水平与患者的生存呈负相关［30］。Das等［31］检测了17例转移性NSCLC患者CTCs的ERCC1的表达水平，数据同样显示ERCCl表达水平与患者的PFS呈现负相关。ERCC1无表达的患者的PFS明显长于高表达的患者（172、226 d，P＜0.05）。

CTCs的检测可为肿瘤的个体化治疗提供最有效、最实时的依据。对肿瘤治疗疗效的提高提供有力的支持。

4　展　望

随着人们对CTCs的认识不断加深及检测技术的持续进步，CTCs重要性及其价值越来越被人们认可。CTCs检测具有无创性及可重复性的优点，CTCs检测在肺癌转移的早期诊断及评估预后方面具有重要意义。其可以作为目前影像学检查的有益补充，以评估治疗疗效，并可以指导分子靶向药物的应用，进一步促进个体化治疗的发展。目前CTCs检测方法处于飞速发展阶段，但仍有以下问题需要解决：（1）需进一步改进检测技术及设备，使其CTCs检测特异性及敏感性有待进一步提高；（2）进一步从分子水平上深化肺癌及其他肿瘤发生、发展、转移和复发机制，促进CTCs在临床上的应用；（3）需开发简单有效的检测设备，降低检测相关费用。

总之，随着人们对CTCs研究的持续发展，必将使CTCs更加利于NSCLC的诊疗。期待CTCs的检测在不久的将来给广大NSCLC患者带来更大的福音。

［1］Jemal A，Bray F，Center MM，et al．Global cancer statistics［J］．CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90．

［2］ Nurwidya F，Takahashi F，Murakami A，et al.Epithelial mesenchymal transition in drug resistance and metastasis of lung cancer［J］.Cancer Res Treat，2012，44（3）：151-156.

［3］Donato BM，Burns L，Willey V，et al．Treatment patterns in patients with advanced breast cancer who were exposed to an anthracycline，a taxane，and capecitabine：a descriptive report［J］．Clin Ther，2010，32（3）：546-554．

［4］ Pachmann K，Clement JH，Schneider CP，et al.Standardized quantification of circulating peripheral tumor cells from lung and breast cancer［J］. Clin Chem Lab Med，2005，43（6）：617-627.

［5］Barrière G，Tartary M，Rigaud M.Epithelial mesenchymal transition：a new insight into the detection of circulating tumor cells［J/OL］．ISRN Oncol，2012-04-11［2015-12-01］．http：//xueshu.baidu.com/s？wd=paperuri%3A%280d 167c87ffa274e6554f52caaa8998fe%29&filter=sc_long_sign&tn=SE_xueshusource_2kduw22v&sc_vurl=http%3A%2F%2Fwww.ncbi.nlm.nih.gov% 2Fpubmed%2F23466142&ie=utf-8．

［6］Sleijfer S，Gratama JW，Sieuwerts AM，et al.Circulating tumour cell detection on its way to routine diagnostic implementation［J］.Eur J Cancer，2007，43（18）：2645-2650.

［7］Hou JM，Krebs M，Ward T，et al.Circulating tumor cells as a window on metastasis biology in lung cancer［J］．Am J Pathol，2011，178（3）：989-996．

［8］Khoja L，Backen A，Sloane R，et al．A pilot study to explore circulating tumour cells in pancreatic cancer as a novel biomarker［J］．Br J Cancer，2012，106（3）：508-516．

［9］Alunni-Fabbroni M，Sandri MT.Circulating tumour cells in clinical practice：methods of detection and possible characterization［J］．Methods，2010，50（4）：289-297．

［10］Ji XQ，Sato H，Tanaka H，et al．Real-time quantitative RT-PCR detection of disseminated endometrial tumor cells in peripheral blood and lymph nodes using the Light Cycler System［J］．Gynecol Oncol，2006，100（2）：355-360.

［11］Negin BP，Cohen SJ.Circulating tumor cells in colorectal cancer：past，present，and future challenges［J］．Curr Treat Options Oncol，2010，11（1/2）：1-13．

［12］Bevilacqua S，Gallo M，Franco R，et al．A"live"biopsy in a small-cell lung cancer patient by detection of circulating tumor cells［J］．Lung Cancer，2009，65（1）：123-125.

［13］Kurusu Y，Yamashita J，OgawaM，et al．Detection of circulating tumor cells by reverse tyanscriptase—polymerase chain reaction in patients with respectable non—small—cell lung cancer［J］．Surgery，1999，126（5）：820-826.

［14］Jemal A，Thomas A，Murray T，et al.Cancer statistics，2002［J］.CA Cancer J Clin，2002，52（1）：23-47.

［15］Krebs MG，Sloane R，Priest L，et al.Evaluation and prognostic significance of circulating tumor cells in patients with non-small-cell lung cancer［J］.J Clin Oncol，2011，29（12）：1556-1563.

［16］陈燕，李虎，秦琴，等.非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞的检测及与病理分期关系［J］.临床军医杂志，2014，42（2）：192-194.

［17］李晶，姜北，万鹏，等.晚期非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞检测的临床意义［J］.中国全科医学，2013，16（9c）：3202-3204.

［18］Punnoose EA，Atwal S，Liu W，et al.Evaluation of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in non-small cell lung cancer：association with clinical endpoints in a phaseⅡclinical trial of pertuzumab and erlotinib［J］. Clin Cancer Res，2012，18（8）：2391-2401.

［19］Cristofanilli M，Hayes DF，Budd GT，et al．Circulating tumor cells：a novel prognostic factor for newly diagnosed metastatic breast cancer［J］．J Clin Oncol，2005，23（7）：1420-1430．

［20］Hofman V，Ilie MI，Long E，et al．Detection of circulating tumor cells as a prognostic factor in patients undergoing radical surgery for non-small-cell lung carcinoma：comparison of the efficacy of the Cell Search Assay？and the isolation by size of epithelial tumor cell method［J］．Int J Cancer，2011，129（7）：1651-1660．

［21］Hou JM，Krebs MG，Lancashire L，et al．Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumormicroemboli in patients with small-cell lung cancer［J］．J Clin Oncol，2012，30（5）：525-532．

［22］Hofman V，Bonnetaud C，Ilie MI，et al.Preoperative circulating tumor cell detection using the isolation by size of epithelial tumor cellmethod for patients with lung cancer is a new prognostic biomarker［J］.Clin Cancer Res，2011，17（4）：827-835.

［23］Rolle A，Gunzel R，Pachmann U，et al．Increase in number ofcirculating disseminated epithelial cells after surgery for non-small cell lung cancer monitored by MAINTRAC（R）is 3 predictor for relapse：a preliminary report［J］．World J Surg Oncol，2010，3（1）：18．

［24］Kimura H，Kasahara K，Kawaishi M，et al.Detection of epidermal growth factor receptor mutations in serum as a predictor of the response togefitinib in patients with non-small-cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2006，12 （13）：3915-3921.

［25］Maheswaran S，Sequist LV，Nagrath S，et al.Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells［J］.N Engl J Med，2008，359（4）：366-377.

［26］Sequist LV，Bell DW，Lynch TJ，et al．Molecular predictors of response to epidermal growth factor receptor antagonists in non-small-cell lung cancer［J］．J Clin Oncol，2007，25（5）：587-595.

［27］Gasch C，Bauernhofer T，Pichler M，et al．Heterogeneity of epidermal growth factor receptor status and mutations of KRAS/PIK3CA incirculating tumor cells of patients with colorectal cancer［J］．Clin Chem，2013，59（1）：252-260．

［28］Pailler E，Adam J，Barthélémy A，et al．Detection of circulating tumor cells harboring a unique ALK rearrangement in ALK-positive non-small-cell lung cancer［J］．J Clin Oncol，2013，31（18）：2273-2281.

［29］Ilie M，Long E，Butori C，et al．ALK-gene rearrangement：a comparative analysis on circulating tumour cells and tumour tissuefrom patients with lung adenocarcinoma［J］．Ann Oncol，2012，23（11）：2907-2913.

［30］刘斌，刘德森，潘泓，等.ERCC1、RRM1基因表达与非小细胞肺癌患者预后的相关性［J］.中国癌症防治杂志，2012，4（3）：251-255.

［31］Das M，Riess JW，Frankel P，et al.ERCC1 expression in circulating tumor cells（CTCs）using a novel detection platform correlateswith progressionfree survival（PFS）in patients with metastatic non-small-cell lung cancer （NSCLC）receiving platinum chemotherapy［J］.Lung Cancer，2012，77（2）：421-426.

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.05.026

A

1009-5519（2016）05-0710-04

△，E-mail：luoyi702@163.com。

（2015-12-23）