超声介导微泡促进干/祖细胞移植在缺血性疾病中的应用进展

2016-02-21马骥马苏亚

现代实用医学 2016年3期

马骥，马苏亚

马骥，马苏亚

细胞移植是再生医学领域的研究热点，以骨髓间充质干细胞（BMSCs）和内皮祖细胞（EPCs）为主的细胞移植已用于心梗等缺血性疾病的研究中。因其易于获得、稳定性好、且可向心肌细胞或内皮细胞分化，能有效地促进组织修复和血管新生，是治疗缺血性疾病的理想靶细胞。然而，既往研究发现，细胞移植因存在移植效率低、存活细胞数量少及靶向性差等缺点而限制了其应用。超声介导微泡破坏（US +MB）技术是指在特定部位采用一定声强的超声波辐照破坏微泡，所产生的冲击波、微射流通过空化效应及声孔效应等作用于周边的细胞、组织，并增加其通透性，利于外源性物质到达靶部位而发挥疗效。因其具有安全无创、靶向性好及可重复应用等优点，已广泛应用于如基因、药物的靶向输送，血脑屏障的开放等。近来研究发现超声联合微泡可促进干/祖细胞靶向归巢，从而治疗心梗、肢体缺血等疾病，本文就其在缺血性疾病中的应用进展作一综述。

1 超声介导微泡促进干/祖细胞移植的作用机制

1.1 增加细胞膜、血管壁通透性超声微泡通过空化效应、声孔效应、机械效应与周边细胞、组织相互作用，增加其通透性。（1）空化及声孔效应：微泡作为一种外源性的空化核，可明显降低超声波发生空化效应的空化阈值。在一定强度的声场中，微泡在低声压时产生稳态空化，在声场中沿着平衡半径左右振荡，重复收缩和膨胀并在其周围产生微射流，使微泡周边存在极高的剪切力，这种剪切力作用于毛细血管内皮细胞的离子通道及其表面受体，导致细胞膜通透性发生改变；微泡在高声压时产生瞬态空化，在超声场负压相迅速膨胀，正压相急剧收缩至内爆，微泡破坏产生的强大冲击波和高速微射流直接作用于细胞膜，使其表面形成短暂开放的小孔，有利于细胞外物质进入胞内。大鼠血管经超声破坏微泡作用后在电镜下观察细胞表面可见许多大小不一、呈火山口样的小孔，继续培养24h后发现小孔消失，说明此效应造成细胞表面的结构变化是可逆的。（2）机械效应：微泡在声场中不断收缩和膨胀，对血管内皮细胞产生机械牵拉，使细胞间紧密连接被撑开，细胞间隙增宽、毛细血管通透性增加，有利于细胞穿过内皮层迁移至受损部位。

1.2 提供适宜的微环境干/祖细胞动员、迁移、黏附生存及最终分化与其所处的微环境密切相关，微环境的改变可引起干细胞某段基因序列的沉默而影响其最终分化，创造一个适宜的微环境对于细胞移植的成功至关重要，而超声与微泡作用产生的适度的炎症反应可为细胞移植提供适宜的“微环境”，有利于干/祖细胞的动员及归巢：通过空化效应破坏组织毛细血管，增加周围细胞的氧化应激，启动局部炎症反应，促进巨噬细胞、T淋巴细胞等炎症细胞浸润，增加损伤局部趋化因子基质细胞衍生因子-1（SDF-1）、黏附分子血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、促血管生长因子血管内皮生长因子（VEGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达，促进干/祖细胞的动员，增加其同内皮细胞的黏附，提高细胞移植效率，并促进其进一步分化为心肌细胞、内皮细胞参与损伤组织的修复，参与血管新生。

2 超声辐照参数的选择

不适当的超声辐照会引起组织损伤及过度炎症反应，微泡破裂亦会导致细胞坏死及组织出血等不良反应。实际操作中需选择最佳超声辐照参数，在避免可能引起的不良反应的前提下提高细胞移植的效率。

在一定频率下，当声强超过适宜的范围时，细胞的增值活性逐渐降低、死亡率逐渐增加。Zhong等观察到在声强0.5W/cm2条件下，心肌细胞肌小节清晰、线粒体规则；声强1.0W/cm2时，心肌细胞膜平滑完整，线粒体轻微肿胀、形态不规则，部分可见空泡样改变，HE染色仅见轻微的炎症细胞浸润和适度的组织损伤；但当声强达到2.0W/cm2时可观察到肌丝溶解，线粒体肿胀紊乱，部分线粒体嵴缩短甚至缺失，HE染色可见明显的组织出血及过度的炎症反应。因此目前研究多认为在频率1.0MHz，声强1.0W/cm2的条件下利用超声波辐照破坏微泡对移植细胞的增值、凋亡，细胞活力无明显影响，且所产生的VEGF、SDF-1及VCAM-1等细胞因子可为移植细胞提供适宜的微环境。

3 干/祖细胞移植治疗缺血性疾病的可能机制

目前用于研究缺血性疾病治疗的细胞主要有：骨髓来源间充质干细胞及内皮祖细胞，二者在趋化因子作用下动员迁移至缺血部位，参与损伤修复及血管新生，这一复杂反应的完成需多条途径共同参与。

3.1 向心肌细胞分化BMSCs是一种具有多向分化潜能的多功能干细胞，具有高度的自我复制和增值潜能，与心肌共同培养可诱导其向心肌细胞分化，而Wnt信号通路在这一过程中发挥重要作用：经Wnt3a介导的经典Wnt信号通路可提高BMSCs增值迁移能力，利于其到达缺血心肌处；而Wnt5a、Wnt11介导的非经典Wnt信号通路则可诱导其向心肌细胞分化，促进BMSCs在缺血心肌组织存活、增加心肌细胞数量、修复受损心肌、改善心功能。

3.2 向血管内皮细胞分化EPCs是血管内皮细胞的前体细胞，主要来源于骨髓、脐带血和外周血，在一些趋化因子的作用下可动员、迁移、归巢至缺血部位，通过分化为成熟的血管内皮细胞并分泌VEGF等细胞因子参与缺血组织的血管新生及损伤内皮的修复。Notch、PI3K/Akt、MAPK信号通路均参与EPCs生物学功能调控，而PI3K/Akt是其中有代表性的一条：它可通过磷酸化作用抑制Akt下游的促凋亡基因FOXO4、促凋亡蛋白BAD、caspase-9活性，抑制EPCs凋亡、促进其增殖；也可激活Akt下游内皮型一氧化氮合酶（eNOS）并产生NO，促进EPCs动员迁移、归巢和分化。

3.3 促进细胞因子的分泌BMSCs与EPCs可通过旁分泌作用增加VEGF、SDF-1及VCAM-1等因子的分泌。其中VEGF和SDF-1可促进干/祖细胞的归巢与分化，VCAM-1可增加细胞与内皮的粘附，这些因子共同作用可有效修复受损内皮，促进血管新生，增加毛细血管密度，改善心肌灌注和心功能。

4 超声介导微泡促进干/祖细胞移植在缺血性疾病中的应用

4.1 心肌梗死（MI）

4.1.1 BMSCs梗死心肌不能再生是心梗后治疗的一大难题，而BMSCs作为一种多能干细胞，可向心肌细胞、内皮细胞分化，是心梗再生治疗的理想靶细胞。Song在大鼠梗死心肌处利用超声波辐照破坏微泡后电镜观察可见血管内皮细胞间隙增宽、微血管破裂，再予BrdU标记BMSCs移植治疗，发现与单独BMSCs治疗组相比，微泡干预后梗死心肌处BrdU阳性细胞数量明显增多、内皮细胞和平滑肌细胞形成的新生毛细血管密度明显增加，且治疗1个月后心功能各项指标均较单独细胞治疗组显著改善；Li报道超声破坏微泡作用可增加缺血心肌组织趋化因子SDF-1的分泌，同时上调BMSCs表面SDF-1受体CXCR4的表达，有效促进BMSCs动员及归巢；Zhong在梗死心肌处利用超声波分3次辐照破坏微泡后观察到心肌组织内VEGF、SDF-1、VCAM-1的表达明显增加，再予DAPI标记BMSCs移植，发现心肌组织内DAPI阳性细胞数量较对照组明显增多，说明超声破坏微泡作用可通过改变缺血心肌组织微环境来促进BMSCs归巢；有研究者在细胞移植前1周内在梗死心肌处予超声波分3次辐照破坏微泡，同样观察到心肌组织VCAM-1、VEGF及SDF-1等因子表达增加，再予BMSCs移植治疗4周，发现与单独BMSCs治疗组相比，微泡联合BMSCs移植能更有效促进冠状动脉侧支循环形成，增加毛细血管密度，提高心肌再灌注；Xu将MI动物模型随机分为4组：PBS对照组、US+MB组、MSCs组、US+MB+MSCs组，用DAPI标记MSCs移植治疗MI，4周后观察到US+MB+MSCs组梗死心肌局部DAPI阳性细胞数量明显多于MSCs组，且梗死区域VEGF、VCAM-1等因子的表达明显增多，新生毛细血管密度、心肌灌注明显增加，心肌纤维化及心室重塑得到有效抑制，心功能明显改善，说明超声破坏微泡作用可有效促进MSCs靶向归巢并促进其发挥疗效；Tong等将具有生物效能的NO载入传统超声微泡中，在心前区利用超声波辐照破坏微泡使NO靶向释放到心肌组织中，再予CM-Dil标记的BMSCs移植治疗MI大鼠，2 d后发现仅在梗死区心肌组织观察到CM-Dil阳性细胞，而正常心肌不表达，且微泡干预后阳性细胞数明显增多，说明此方法可提高细胞移植的靶向性及移植效率，4周后观察到梗死心肌组织毛细血管密度、心肌灌注明显增多，梗死区域SDF-1及VEGF等因子表达明显增加，有效抑制了心室重塑，改善了心功能。

4.1.2 EPCsEPCs可促进心梗后心肌组织血管新生，增加其血流灌注，改善心功能。李巧利用超声微泡联合EPCs移植治疗MI大鼠，4周后超声心动图显示左室短轴缩短率和左室射血分数明显提高，心肌组织局部微血管密度、VEGF蛋白的表达明显增加，缺血心肌的血供及心功能得到显著改善。

以上研究均证实，利用超声破坏微泡作用可增加缺血心肌局部SDF-1、VEGF及VCAM-1等因子的表达，有效促进干/祖细胞动员、归巢及分化，增加局部毛细血管密度，提高心肌再灌注血流量，最终改善心功能、抑制心肌纤维化及心室重塑，并影响其预后。

4.2 心肌病心肌病常由于心肌血管新生能力受损，毛细血管数量减少引起心肌细胞缺血坏死最终导致心衰，增加心肌的血流灌注或可延缓其心衰的发生发展。Zen等研究发现超声破坏微泡作用可增加心肌组织局部VCAM-1及ICAM-1等黏附因子的表达，促进EPCs同内皮层黏附并分化为成熟内皮细胞，并与VEGF、bFGF等血管生长因子共同作用促进心肌组织的血管新生；Zen等利用超声微泡联合Dil标记的EPCs移植治疗心肌病仓鼠，2周后观察到心肌组织内Dil阳性细胞数量明显多于对照组，12周后观察到心肌组织毛细血管密度、心肌细胞密度明显增加、凋亡细胞数量减少、间质纤维化减轻、左心室重量减轻，心肌组织的血流灌注明显增多，微泡联合细胞移植有效抑制了心室重塑，延缓心力衰竭进程。

4.3 肢体缺血利用超声破坏微泡产生的一系列生物效应可促进缺血肢体的治疗性血管新生。Song等报道超声破坏微泡后引起的毛细血管破裂能促进骨骼肌新生动脉形成；Yoshida等报道US+MB作用后巨噬细胞、T淋巴细胞等炎症细胞浸润可增加局部VEGF等血管生长因子的分泌，促进缺血肢体的血管新生及动脉生成；在这些研究的基础上，Imada首先将微泡与细胞移植相结合并证实了其在缺血肢体血管新生的作用：微泡破裂引起血小板来源的促炎因子活化，增加缺血局部P选择素表达，有利于移植细胞与损伤内皮的黏附，与单独细胞移植组相比，微泡干预后缺血肢体新生毛细血管数量明显增多，血流灌注显著改善；Enomoto同样证实了超声破坏微泡作用可诱导缺血肢体的血管新生，且与EPCs移植相结合后这种形成新生血管的能力进一步增强。

4.4 糖尿病阴茎勃起功能障碍（DMED）DMED是糖尿病的主要并发症之一，有报道EPCs可治疗糖尿病引起的ED。王英俊利用超声辐照微泡联合EPCs移植治疗DMED大鼠，7 d后观察发现与单纯EPCs移植组相比，微泡干预后大鼠的阴茎勃起次数、勃起率均明显提高，组织学观察海绵体组织新生毛细血管密度、VEGF蛋白表达均明显增加，认为微泡联合细胞移植能够进一步促进缺血海绵体组织的血管新生并最终改善其功能。