Legumain在恶性肿瘤中的表达及意义*

王健君综述，钟树志，李晓敏审校（皖南医学院：.组织学与胚胎学教研室；2.病理学教研室，安徽芜湖24002）

Legumain在恶性肿瘤中的表达及意义*

王健君1综述，钟树志1，李晓敏2△审校
（皖南医学院：1.组织学与胚胎学教研室；2.病理学教研室，安徽芜湖241002）

天冬酰胺；肿瘤；内皮细胞；巨噬细胞；肿瘤侵润；细胞外基质；综述

Legumain又称天冬酰胺内肽酶（asparaginylendopeptidase，AEP），是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，最初是在豆类植物（legumainous plants）种子中发现的。随后在人体也发现了Legumain，其基因定位于14号染色体，与动脉粥样硬化、脑退行性变、肝脏纤维化、抗原加工处理等病理生理过程密切相关。2003年，Liu等［1］最先报道了Legumain与肿瘤关系密切，并通过免疫组织化学方法检测了人乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌及中枢神经系统恶性肿瘤等组织中Legumain的表达，结果发现Legumain在这些肿瘤组织中均呈高表达，而在相应的正常组织中不表达或表达水平极低。随后的研究表明，Legumain在人胃癌［2］、葡萄膜黑色素瘤［3］、横纹肌肉瘤［4］等恶性肿瘤中也高表达，其表达能够增强肿瘤细胞的运动、增殖和迁移能力，对肿瘤微环境也有重要作用。根据Legumain能够特异性地在恶性肿瘤高表达这一特点，以Legumain为靶点进行的肿瘤疫苗研制、肿瘤体内成像和药物靶向性研究等也取得了一些进展。本文就Legumain在恶性肿瘤组织中的表达特点、意义及相关靶向性研究作一综述。

1　Legumain在恶性肿瘤中的表达及作用

1.1Legumain在恶性肿瘤组织中高表达的原因及机制肿瘤组织普遍存在的缺氧环境是Legumain高表达的主要原因［5］，这也解释了最初发现Legumain在多种肿瘤组织中高表达，而在体外培养的相应肿瘤细胞株中却不表达的原因［1］，缺氧条件下培养肿瘤细胞则能够诱导Legumain高表达。此外，在细胞内存在天然的半胱氨酸蛋白酶抑制物E/M（cystatin E/M），又称Cystatin 6（CST6），其在肿瘤组织内表达缺失也是Legumain高表达的原因之一［6-7］。为探讨Legumain在肿瘤组织内表达水平增高的分子机制，Yamane等［8］通过计算机分析及染色质免疫共沉淀发现并验证了p53与人Legumain基因内含子1区域存在结合位点，通过体外培养人大肠癌细胞HCT116和人肺癌细胞H1299，分别沉默和上调p53基因的表达，证实p53可在转录水平调控Legumain的表达。同样，在对乳腺癌的研究中也发现p53与Legumain的表达呈正相关［9］。此外，有研究表明，Legumain也是核质内第二信使Ca2+调控细胞增殖的靶基因之一，生物信息学分析发现，Legumain启动子区可能存在转录因子Elk-1的结合位点，核质内Ca2+可能是通过Elk-1调控Legumain表达［10］。

1.2Legumain在恶性肿瘤细胞中的表达特点及临床意义在人大肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌等恶性肿瘤组织高表达的Legumain与患者的不良预后相关，Legumain是判断患者预后和总体生存率的新型标记物。有学者进一步研究了人恶性肿瘤细胞Legumain免疫组化阳性染色方式及部位与患者预后的关系。Gawenda等［11］在人浸润性乳腺癌组织中观察到Legumain在乳腺癌细胞细胞质的阳性表达方式有3种：弥漫性（diffuse）、细点状（tiny dots）和囊泡状（vesicles），其中呈囊泡状阳性与患者的不良预后相关，而呈弥漫性阳性与细点状阳性与患者的预后并不具有相关性。Ohno等［12］在前列腺癌手术切除标本的免疫组化染色中同样观察到Legumain在肿瘤细胞质中有弥漫性和囊泡状2种阳性表达方式，表现为囊泡状阳性的肿瘤常同时具有包膜侵犯、神经侵犯、Gleason评分高的特征，并且患者生存率明显低于弥漫性阳性者。最近，有研究在人结肠癌手术切除标本中观察到Legumain除在肿瘤细胞质表现为弥漫性或颗粒状（granulated）阳性外，大约30%的结肠癌标本Legumain阳性表达于肿瘤细胞核 （nuclear），统计分析表明，肿瘤细胞核阳性的患者总体生存率明显降低，而肿瘤细胞质颗粒状与弥漫性阳性患者生存率并无差异［13］。Legumain在肿瘤细胞的阳性表达方式有望成为预测恶性肿瘤患者预后的标记物，但需要更多的研究进一步支持并验证这种相关性。

1.3Legumain在肿瘤微环境中的表达及作用肿瘤微环境是肿瘤细胞赖以生长的复杂环境，包括肿瘤细胞外基质及多种细胞成分，如肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAM）、成纤维细胞，血管内皮细胞等，肿瘤细胞与肿瘤微环境之间相互作用共同促进肿瘤的发生、发展、侵袭及转移［14］。Legumain在肿瘤微环境中的新生血管内皮细胞、肿瘤相关巨噬细胞中也高表达。肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，属于M2型巨噬细胞，通过分泌多种生长因子、血管生成因子、蛋白酶等促进肿瘤基质重构、新生血管生成、肿瘤细胞增殖及转移。Solberg等［15］在体外诱导单核细胞向巨噬细胞分化过程中观察到Legumain的表达升高，特别是在M2型巨噬细胞中的表达更显著。Luo等［16］发现，乳腺癌组织中肿瘤相关巨噬细胞高表达Legumain，而起到免疫监视和抗原提呈作用的M1型巨噬细胞则不表达Legumain，由于这一表达特点，靶向Legumain杀伤肿瘤相关巨噬细胞的药物不会干扰M1型巨噬细胞的细胞毒反应及抗原提呈等生物学功能。吴文苑等［17］为研究肿瘤新生血管内皮细胞高表达的Legumain对血管内皮的影响，在低氧条件下培养人血管内皮细胞株HUVEC，使Legumain高表达，血管内皮细胞的管腔形成增多，表明在肿瘤组织血管内皮细胞高表达的Legumain可能促进肿瘤新生血管的形成，改善肿瘤血供，促进肿瘤生长。

1.4Legumain高表达对恶性肿瘤细胞的作用及机制Legumain在恶性肿瘤组织的表达增高主要起到促进恶性肿瘤细胞侵袭及转移的作用。Wu等［9］对人乳腺癌切除标本通过免疫组化方法观察到乳腺癌细胞Legumain的表达与淋巴结转移相关，认为Legumain可能参与了乳腺癌的转移过程。同样，国内吴文苑等［17］体外培养人乳腺癌细胞系MDA MB231，在不同浓度Legumain蛋白的作用下，随着Legumain蛋白浓度的增加，乳腺癌细胞的迁移能力明显增强。在体外培养的胃癌［2］和卵巢癌［18］细胞中，也同样观察到Legumain过表达能够促进恶性肿瘤细胞的迁移及浸润。Li等［2］进一步通过制备稳定过表达Legumain的裸鼠胃癌肿瘤模型，注射给予Legumain抑制剂（APEI）抑制Legumain表达，证实Legumain在体内也能够明显抑制肿瘤的生长及转移。Legumain促进恶性肿瘤细胞侵袭及转移的机制目前仍不明确，研究认为，Legumain主要通过蛋白水解作用活化组织蛋白酶［19］，如组织蛋白酶B、L（cathepsins B、L），降解肿瘤基质，促进肿瘤细胞的侵袭及转移。此外，在多种恶性肿瘤组织中，Legumain的表达与基质金属蛋白-2（MMP-2）的表达及活性也呈正相关［1-2］，但Legumain能否直接调控MMP-2的表达及活化仍需进一步研究。除MMP-2外，另一备受关注的分子为整合素，在迁移中的大肠癌、乳腺癌等恶性肿瘤细胞前端均发现Legumain与整合素有重叠［1，9］，Legumain可能通过整合素途径促进肿瘤细胞的迁移及转移。

虽然Legumain在体内能够促进肿瘤的生长，但对体外培养的胃癌及卵巢癌细胞却没有促进增殖的作用［2，18］，这可能与肿瘤在体内及体外的生长环境不同有关。但是，Andrade等［10］在体外培养人肝癌细胞系SKHep1，通过RNA干扰（RNAi）技术沉默Legumain的表达，发现细胞增殖受到明显抑制，并且通过Legumain抑制剂抑制Legumain活性后，并未影响Legumain促进肿瘤细胞增殖的作用，认为Legumain促进肿瘤细胞增殖的作用是独立于其蛋白水解酶活性之外的，进一步研究发现，Legumain基因沉默抑制肿瘤细胞增殖是由于影响了细胞周期，减少了处于G2/M期细胞的比例，而不是通过促进凋亡作用。而吴文苑等［20］的研究发现，体外培养能够稳定过表达Legumain的人胚胎肾细胞株HEK293，应用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和放线菌酮（CHX）共同诱导细胞凋亡，表明Legumain过表达能够抑制凋亡。D′Costa等［7］也在实验中发现，Legumain过表达能够抑制体外培养的乳腺癌细胞的凋亡，进而促进乳腺癌细胞的增殖。因此，Legumain在体外是否具有促进肿瘤细胞增殖及抑制凋亡的作用仍存在不同观点。

2　Legumain在肿瘤诊断成像技术中的应用

肿瘤诊断成像技术主要包括磁共振成像（MRI）、正电子发射计算机断层扫描（PET）、X射线断层扫描光影像（CT）、超声造影、荧光分子成像等［21］。利用荧光探针对肿瘤早期病变进行靶向性识别和诊断是研究的热点。已有多项研究以Legumain为靶点进行荧光探针的开发。Edginfton等［22］设计开发了基于Legumain活性的荧光标记探针，能够与Legumain特异性共价结合而发出荧光，实现体内肿瘤的无创性成像，更具特异性和有效性。此外，Chen等［23］开发了一种新型的MRI对比剂和近红外荧光探针，能够增强表达Legumain肿瘤的成像。而Jiang等［24］基于分子动力学模拟方法设计了荧光共振能量转移（FRET）探针，用于检测体内Legumain，能够灵敏地检测早期肿瘤。

3　以Legumain为靶点研制肿瘤基因疫苗

基因疫苗是将编码抗原的基因通过载体导入体内，使其在一定时限内能持续表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫反应，达到防病治病的作用。由于基因疫苗可以激活细胞毒T淋巴细胞而诱导细胞免疫，因此是抗肿瘤免疫领域的研究热点。近年来，有研究针对Legumain进行了抗肿瘤基因疫苗的研制。Smahel等［25］为提高Legumain基因疫苗诱导的有效免疫效应，对Legumain基因进行了一些修改，首先，使Legumain保守序列RGD序列突变为GGD或RGG，然后插入破伤风毒素p30表位，从而减少了成熟Legumain的产生，增强了免疫原性，通过基因枪给药后，显著增强了机体对legumain的免疫应答反应。而Lewēn等［26］构建了编码Legumain的H-2D 和H-2K的小基因病毒表达载体，转染入鼠伤寒沙门菌中制成疫苗，可口服给药，小基因疫苗具有与全基因疫苗相似的抗肿瘤效果，能够抑制小鼠乳腺癌的生长及转移，且比全基因疫苗更具有灵活性。Karyampudi等［27］为解决肿瘤微环境普遍存在的免疫抑制作用对基因疫苗诱导的免疫效应的消减问题，提出联合用药能够增强疫苗的抗肿瘤效应，针对肿瘤抑制免疫的主要机制PD-1/B7-H1抑制轴，应用抗PD-1抗体和包括Legumain在内的多肽疫苗联合给药观察其对小鼠乳腺癌的治疗作用，发现这种方法能提高抗肿瘤免疫效应，延长小鼠的生存期，具有重要的临床应用价值。

4　开发Legumain激活的抗肿瘤前体药物

化疗药物由于对细胞没有选择性而常导致一些不良反应，如心脏、肾脏损害、骨髓抑制、脱发等，Legumain是人体内唯一一种天冬酰胺肽链内切酶，在肿瘤组织特异性高表达，而正常组织不表达，这一表达特点为化疗药物的靶向性研究提供了新思路。Smith等［28］设计合成了秋水仙素的前体药物，能够被Legumain特异性地裂解而激活，不但提高肿瘤细胞对前体药物的摄取率，而且高浓度药物集中在癌灶内也降低了对正常细胞的毒副作用，增强抗癌活性，改善肿瘤患者对药物的耐受性。Liu等［29］设计合成了有丝分裂抑制剂E（MMAE）的前体药物8，该前体药物能够与肿瘤细细胞膜表面高表达的糖蛋白整合素αvβ3相连，并被Legumain催化为有活性的MMAE，在动物实验中能有效抑制乳腺癌的生长和转移，并且对白细胞的毒性极低。此外，Liu等［30］通过改造携带化疗药物的载体以实现药物高效、特异性地靶向肿瘤，他们设计开发了一种Legumain蛋白激活的AANTAT-脂质体载体，该脂质体所携带的AAN为Legumain的底物丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺，TAT为一种细胞穿膜肽，能携带大分子物质进入细胞，AAN的添加使TAT的跨膜转运能力下降，通过实验证实，在肿瘤部位高表达的Legumain的催化下，TAT脂质体能够被释放并恢复穿膜能力，进入肿瘤细胞发挥杀癌效应，为提高抗癌药物的靶向性、高效性、低毒性提供了一种新方法。

综上所述，Legumain作为一种新发现的与肿瘤侵袭及转移密切相关的蛋白酶，对肿瘤细胞和肿瘤微环境都有重要的作用，进一步阐明Legumain在肿瘤生长和转移中的作用及机制，以及Legumain表达的调控机制，可为恶性肿瘤的诊断、治疗和预防提供新的靶点。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2016.07.021

A

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（2015-12-08）