人脐带间充质干细胞制剂创制的关键技术研究

潘兴华，庞荣清，阮光萍，朱向情，蔡学敏，何 洁，赵 晶，刘高米洋

人脐带间充质干细胞制剂创制的关键技术研究

潘兴华，庞荣清，阮光萍，朱向情，蔡学敏，何 洁，赵 晶，刘高米洋

脐带；间充质干细胞；制剂；关键技术

脐带间充质干细胞 （human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSC）来源于新生儿脐带，具有自我复制和多向分化能力，在体内外特定环境诱导下，可分化为骨、软骨、肌肉、肝、内皮和心肌等功能细胞[1]。与骨髓和脂肪来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）相比，HUC-MSC采集方便、来源充足、可规模化、标准化生产与储存，无伦理学争论，是最具有产业化和临床应用前景的干细胞之一。鉴于HUC-MSC的可塑性和免疫调节作用，在临床上可用于衰老、退变、损伤性疾病的治疗，例如肝肾损伤、脊髓损伤、退行性病变、移植物抗宿主病（GVHD）以及自身免疫性疾病等的治疗[2]。笔者对研制UC-MSC制剂的关键技术进行了概述。

1 HUC-MSC及其临床制剂制备

1.1 HUC-MSC制备实验室基本要求 实验室总体设计、布局、建造、改造、维护必须符合细胞制备的流程要求和人流物流分流的原则，最大限度地有利于环境净化，避免污染和交叉污染，便于清洁、操作和维护。建筑平面和空间布局应具有灵活性，主体结构应具有耐久性。实验室洁净区应包括细胞采集室、准备室、细胞分离室、细胞培养室、细胞检测室、质量控制室，非洁净区应包括气体储存室、物料储存室、试剂储存室、办公室、监控中心、资料档案室、质量控制室，洁净区应与非洁净区不可交叉过往。细胞制备实验室洁净区主要以微粒和微生物为主要控制对象，动态环境要求达到B级,即≥5.0 μm悬浮粒子不超过352000,≥0.5 μm悬浮粒子不超过2900,浮游菌(cfu/m2）和沉降菌(cfu/皿）均≤1操作台要求达到A级，即≥5.0 μm悬浮粒子不超过3520,≥0.5 μm悬浮粒子不超过20,浮游菌(cfu/m2）≤5，沉降菌(cfu/皿）3≤1。

1.2 HUC-MSC的采集 体外制备并用于临床治疗的HUC-MSC是一种特殊“药物”，首先必须符合生物制剂基本要求，其次要符合临床输血标准，还要保证细胞的均一性和生物活性。因此，在体外制备的每一个环节都应在洁净环境中进行，防止微生物及病毒等有害因子污染，要在特定的环境中进行操作，以保持细胞的功能。

脐带采集是质量保证的第一关，应对采集细胞的技术方法和安全性、可行性、稳定性进行质量控制。采集前应对产妇进行健康检查，按临床输血标准排除病源生物，包括爱兹病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、巨细胞病毒（CMV）、人类疱疹病毒（EB）病毒，同时要存留血样存2个月后重复检查，排除潜伏期感染，有条件的还应进行染色体遗传分析和有针对性的遗传病基因检测，尽可能从源头上排除不利因素[3]。采集过程应在无菌条件下进行，尽可能使用一次性无菌器材，防止共用设备和设施带来的交叉污染。采集后的脐带应立即置于无菌器皿的营养液中并迅速转移到细胞制备实验室进行加工处理。

1.3 HUC-MSC的制备 UC-MSC生产制备的每一个环节都有可能影响制剂的质量，直接决定着临床的安全性和有效性，需对UC-MSC制备的每一个环节进行标准化研究和控制。本实验室采取设施条件、设备、试剂固定，技术操作人员分组相对稳定，技术操作方法一致的方式实施。体外细胞制备过程应制定详细的技术操作规程（SOP），严格按照操作规范对脐带进行洗涤、去除外膜和血管等，尽可能剪碎至1 mm3以下，充分离心洗涤后采用组织块贴壁培养法进行分离培养，为提高效率和节约资源，可对组织块反复3次进行贴壁培养。一般采集长40～50 cm的脐带，可用75 cm2的塑料培养瓶进行培养,按0.8～1 cm/瓶分散。保守计算，一般原带培养12～14 d可达到80%～90%细胞融合水平，按常规方法传代后4～6 d可长满瓶底，收集储存1～2代细胞作为种子细胞。一条长50 cm的脐带可获得2代种子细胞2×109个，培养至第5代可获得6×109个细胞，至少可满足900人的临床治疗需要[4]。本项目组通过重复实验和优化技术方法建立一套简单、稳定且高效的标准化UC-MSCs制备技术以及一种可直接复苏回输的临床级UC-MSCs制剂，结果为临床治疗和相关研究提供了技术和标准化UC-MSCs制剂。该研究用首次贴壁洗脱下来组织块继续接种培养，能使原代产量翻倍，且都获得了均一性较好的HUC-MSC。将收集生长较好的第3代UC-MSC，以临床治疗用平衡液为基础，添加白蛋白、二甲基亚砜等细胞保护剂，按1×106细胞/ml的密度配制成临床级UC-MSC制剂，以60 ml/袋的标准分装于细胞储存袋中，采用程序降温和液氮（-196℃）保存法长期低温储存。

2 HUC-MSC临床制剂的安全性评价

UC-MSC研究的最终目标是用于临床疾病治疗，必须把安全性作为前提条件。本项目组按新生物制剂安全性评价要求对HUC-MSC制剂进行了体外溶血试验、急性毒性试验、过敏试验、致瘤与促瘤试验和慢性毒性实验[5]。（1）急性毒性试验：以×108个细胞/kg的剂量标准通过静脉输入小鼠体内，系统观察了临床表现、血液细胞学、血液生化、主要器官病理组织学等指标，结果未见与UC-MSC输入相关的异常表现。（2）体外溶血试验：分别进行了0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 ml的UC-MSC制剂 （浓度为4×105个细胞/ml）的体外溶血观察均未见溶血现象。（3）过敏试验：通过反复3次给豚鼠静脉输入不同剂量（1× 106～5×106细胞/kg）的HUC-MSC，末次输注14 d后，足部静脉注射HUC-MSC观察过敏现象，未见异常临床表现。（4）致瘤试验：采用软琼脂克隆生长和体内皮下接种致瘤试验，大体解剖未见脏器或组织有异常现象，镜检未见接种局部节节生长。（5）慢性毒性试验：反复8次给食蟹猴静脉注射1×106细胞/kg～5×106细胞/kg的HUC-MSC和食蟹猴脐带间充质干细胞（MUC-MSC），各剂量组动物临床观察、体重、体温、心电图、凝血功能和病理学检查均未见有异常改变。可见血清AST、CK升高、无机磷轻度降低、外周血CD3+细胞减少、IL-6分泌增加，但停止输注4 w后恢复。MUC-MSCs重复静脉给予食蟹猴，MUCMSC在血内的暴露程度随剂量增加而增大，在血内有一定的蓄积。 结果显示，HUC-MSC治疗无急性毒性、过敏、溶血和慢性毒性反应，无致瘤现象，长期、反复多次注射无明显慢性毒性，安全范围为1× 106细胞/kg～5×106细胞/kg。

3 HUC-MSC制剂的质量控制技术

HUC-MSC制剂的质量是保证临床治疗的安全性和有效性的基础，建立质量控制技术及标准是关键。本研究建立了如下检测技术体系及标准。

3.1 生物学特性检测 （1）存活率：采用台盼蓝（Trypan blue）染色法，活细胞比例≥95%；（2）形态学：组织贴壁法培养HUC-MSC于第7 d后可见成纤维样细胞爬出，传代后呈典型的漩涡状生长，倍增时间为30～36 h；（3）表型：第3代细胞高表达CD29、CD44、CD90、CD105≥95%，低表达或不表达CD34、CD14、CD45、CD31和HLA-DR≤2%；（4）生长特性：细胞生长曲线呈“S”型；（4）分化潜能：体外诱导可成脂、成骨、成软骨分化；（5）分泌功能：分泌27种细胞生长因子；（6）细胞均一性:细胞纯度≥95%，G0～G1期细胞比例为76～81%，M期细胞比例为8～12%；(7)免疫调节功能：体外共培养方法，抑制PHA刺激的T淋巴细胞增殖和IFN-γ分泌，抑制率与HUC-MSC数量呈正相关[6]。

3.2 病原生物及残留物检测 （1）细菌检测：于UC-MSCs培养前后分别参照现行《中国药典》细胞无菌实验规程进行。在进行临床治疗前，应检测外源感染因子，结果阴性方可用于临床治疗；（2）支原体检测：采用快速PCR法（支原体检测试剂盒）；（3）病毒检测：HIV、HAV、HBV、HCV、梅渡螺旋体（TPPA）、CMV、EB病毒检测分别采用抗体检测发和PCR技术两种方法同时进行，除常规检测方法外，也可用电镜、免疫组化、免疫荧光抗体、放射免疫、酶联免疫吸附法和多聚酶联反应等方法进行；（4）内毒素检测：用鲎试剂检测法进行量化检测，内毒素含量符合临床制剂规定限量，低于0.25 Eu/ml；（5）残留成份检测：血清蛋白、抗体、血清、抗生素、固相微粒等，采用相应试剂进行检测，血清残留＜50 ng每袋制剂。

结果显示，HUC-MSCs制剂无细菌、支原体和特定病毒污染，制剂在冻存前细胞活性＞90%，复苏后活性＞85%，细胞表型和生物学功能符合HUC-MSC制剂要求[8]。

4 HUC-MSC制剂的临床应用技术问题与展望

本项目组参照生物制剂研发模式创制出1种新型干细胞临床制剂-HUC-MSC注射液，建立了相应细胞库，解决了UC-MSC产业化和临床应用前的HUC-MSC制备规范化、HUC-MSC制剂标准化和疗效、安全等问题，通过疾病模型治疗实验，探讨了UC-MSC的治疗原理并拟定了临床治疗方案[7]。目前，课题组创制的HUC-MSC注射液已具备临床转化应用的技术条件，但要实现该技术和产品广泛应用，还需要研究和完善一些临床准入、技术及管理问题[8]：（1）按现行干细胞制剂和临床研究管理要求进行HUC-MSC制剂的临床研究申报，获得相应资质方可进入临床研究；（2）通过规范化临床治疗研究，进一步验证临床疗效和安全性，完善临床治疗技术；（3）探讨适应证和个性化治疗方案及机制；（4）建立系统化的UC-MSC制备、质控、储存与运输及与临床接轨的技术和管理流程，利用物联网信息技术建立质量监督体系；（5）通过疾病模型治疗或临床研究，优化适应症选择和治疗途径、剂量、时机、次数等基本参数，建立疗效评价技术及标准。

HUC-MSC制剂可广泛用于涉及组织细胞变性、坏死和缺失的各种损伤、退变性疾病治疗，对自身免疫性疾病、继发性炎症反应、创伤性多器官功能不全、移植免疫排斥反应等疾病的治疗有重要意义[10]。预计将在心脑血管病的康复治疗、肢体创伤和系统性红斑狼疮、糖尿病、延缓衰老和老年性器官功能衰退、器官移植排斥反应、辅助造血干细胞移植治疗、肝硬化、慢性肾功能不全等疾病治疗中发挥重要作用。由于异体甚至是异种UC-MSC治疗不产生明显的免疫排斥反应[10]，UC-MSC在军事医学领域可用于核辐射和 次声、微波、电磁武器等现代高新技术武器伤及生化武器造成的中毒性疾病治疗。在辐射伤治疗中可促进损伤修复和造血免疫重建，提高造血干细胞移植治疗的疗效[11]。对于常规武器导致的局部或复合伤，HUC-MSC治疗可有效防治系统性炎症反应和多器官功能不全并促进创伤修复。

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650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省干细胞工程实验室，昆明市干细胞与再生医学研究重点实验室

潘兴华，E-mail：Xinghuapan@sohu.com.cn