钠泵α2亚基介导低浓度哇巴因影响大鼠心室肌细胞收缩力的作用研究

武彦昭,张 兰，熊 晨

·论著·

钠泵α2亚基介导低浓度哇巴因影响大鼠心室肌细胞收缩力的作用研究

武彦昭,张 兰，熊 晨

【摘要】背景强心苷类(CGs)药物临床治疗心力衰竭因其治疗窗窄使应用受到很大限制。心肌钠泵是CGs药物作用的靶点，然而CGs药物与钠泵相互作用的机制仍有待阐明。目前认为，钠泵的第一个膜外区H1-H2是哇巴因可能的结合位点。目的利用作用在抗心肌钠泵α2亚基H1-H2膜外区结构域的多克隆WJS为工具，封闭该结合位点，有效拮抗哇巴因对钠泵的抑制作用，比较封闭前后哇巴因对心室肌细胞钠泵活性的影响及心室肌细胞收缩力、细胞内钙的变化，探讨钠泵与哇巴因的作用机制。方法2013年1月—2015年1月急性分离大鼠心室肌细胞，将心室肌细胞分为4组，1 μmol/L哇巴因组、WJS+1 μmol/L哇巴因组、1 mmol/L哇巴因组、WJS+1 mmol/L哇巴因组。1 μmol/L哇巴因组给予哇巴因(1 μmol/L)进行灌流；WJS+1 μmol/L哇巴因组以WJS(稀释浓度1∶1 000)孵育心室肌细胞0.5 h后，再给予哇巴因(1 μmol/L)进行灌流；1 mmol/L哇巴因组给予哇巴因(1 mmol/L)进行灌流；WJS+1 mmol/L哇巴因组以WJS(稀释浓度1∶1 000)孵育心室肌细胞0.5 h后，再给予哇巴因(1 mmol/L)进行灌流。采用全细胞膜片钳技术记录钠泵电流(Ip)，观察WJS对哇巴因抑制Ip作用的影响；采用激光共聚焦显微镜测定心室肌细胞游离钙浓度([Ca2+]i)；采用细胞动缘探测系统测定心室肌细胞收缩力的大小。结果Western blotting法检测结果显示，纯化后的WJS在电泳时分别出现2条清晰的条带，其分子量均为 110 kD 左右。细胞免疫荧光法测定结果显示，WJS均结合在心室肌细胞钠泵的膜外区，而且这种结合并不被1 μmol/L哇巴因影响，但却被在H1-H2膜外区特异性抗原点具有相同成分的多肽阻断剂RE2取消。WJS+1 μmol/L哇巴因组高亲和力钠泵电流(Iph)低于1 μmol/L哇巴因组(P<0.05)；1 mmol/L哇巴因组、WJS+1 mmol/L哇巴因组Iph高于1 μmol/L哇巴因组和WJS+1 μmol/L哇巴因组，低亲和力钠泵电流(Ipl)低于1 μmol/L哇巴因组和WJS+1 μmol/L哇巴因组(P<0.05)；WJS+1 mmol/L哇巴因组Iph高于1 mmol/L哇巴因组，Ipl低于1 mmol/L哇巴因组(P<0.05)。灌流5、15 min WJS+1 μmol/L哇巴因组心室肌细胞[Ca2+]i低于1 μmol/L哇巴因组(P<0.05)；灌流5、15 min 1 mmol/L哇巴因组、WJS+1 mmol/L哇巴因组心室肌细胞[Ca2+]i高于1 μmol/L哇巴因组和WJS+1 μmol/L哇巴因组(P<0.05)；灌流5、15 min WJS+1 mmol/L哇巴因组心室肌细胞[Ca2+]i高于1 mmol/L哇巴因组(P<0.05)。灌流5、15 min WJS+1 μmol/L哇巴因组心室肌细胞收缩力低于1 μmol/L哇巴因组(P<0.05)；灌流5 min 1 mmol/L哇巴因组、WJS+1 mmol/L哇巴因组心室肌细胞收缩力高于1 μmol/L哇巴因组和WJS+1 μmol/L哇巴因组，灌流15 min心室肌细胞收缩力低于1 μmol/L哇巴因组和WJS+1 μmol/L哇巴因组(P<0.05)；灌流5、15 min WJS+1 mmol/L哇巴因组心室肌细胞收缩力低于1 mmol/L哇巴因组(P<0.05)。结论抗心肌钠泵α2亚基H1-H2膜外区结构域的多克隆抗体WJS取消Iph和低浓度哇巴因所致的心室肌细胞收缩力增强作用，表明钠泵α2亚基介导低浓度哇巴因治疗心力衰竭的作用。

充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF)是临床上极为常见的心血管综合征，据世界卫生组织(WHO)统计全球心力衰竭发病率为0.5%～2.0%，特别是CHF的患病率呈日益上升趋势，成为住院、病残及死亡的主要原因[1]。目前CHF的治疗仍以强心苷类(CGs)药物为主，辅以利尿剂和血管扩张剂等，但CGs药物有效剂量与中毒剂量接近、不良反应强、治疗窗较窄，使其应用受到很大限制。

CGs药物治疗心力衰竭的机制是其抑制衰竭心室肌细胞膜上钠泵(Na+/K+-ATPase，Na/K pump，NKP)，使细胞内Na+增加，通过Na+/Ca2+交换(NCX)，引起细胞内Ca2+的升高，并促进肌质网对钙的摄取及随后的钙释放(CICR)。增加的内钙一方面可以增加心室肌细胞收缩力即其治疗作用，另一方面当钙的增加超过了肌质网的负荷时则表现为其不良反应[2]。因此，探讨CGs药物如何在减少其不良反应的同时最大限度地发挥其正性肌力作用是目前亟待解决的问题。

钠泵由α、β、γ 3个亚基组成，其最小功能单位是αβ异源二聚体[3]。多种配体如内源性钠泵抑制因子哇巴因、ATP、Na+和K+等，在α亚基膜外区均有结合位点[4]。α亚基分为4种亚型，其中α1亚基被认为是“管家”亚基，啮齿类动物α亚基各亚型与CGs药物如哇巴因的亲和力从α1、α2到α3依次升高；但人类α亚基各亚型对哇巴因的亲和力均很高，因此容易受到哇巴因的作用[5-6]。催化性α亚基存在10个跨膜结构域(H1～H10)，随着对心肌的钠泵结构-功能关系研究的深入，进一步揭示哇巴因结合在钠泵的是α亚基而不是β亚基[7]。点突变研究和氨基酸替代实验证明，将大鼠钠泵α2亚基H1-H2膜外区结构域氨基酸Gln111和Asn122双突变为Asp111和Arg122时，钠泵对哇巴因的亲和力与野生型钠泵相比下降了千倍[8]。由此推测，钠泵抑制因子对钠泵的抑制作用正是通过与钠泵α2亚基H1-H2膜外区结构域氨基酸的结合实现。提示，钠泵α2亚基H1-H2膜外区结构域是哇巴因的主要结合位点，说明该结构域对于哇巴因的作用有着非同寻常的意义。

根据与CGs药物的亲和力不同，α亚基可分为高亲和力亚型和低亲和力亚型。其中，α1亚基对CGs药物的亲和力明显低于α2亚基和α3亚基[9]。例如大鼠心室肌细胞α2亚基仅占11%，给予3×10-7mol/L哇巴因能够抑制94%的α2亚基和1%的α1亚基，但却使收缩力增加约40%，说明α2亚基在调节心室肌细胞收缩方面发挥重要作用[10]。文献报道，钠泵特别是抑制α2亚基调节着哇巴因诱导的心室肌细胞收缩力，而抑制α1亚基则会造成钙超载和非节律性收缩[11]，这为治疗心力衰竭过程中寻找特异性作用于α2亚基的药物提供了参考。

因此，本研究利用作用在抗心肌钠泵α2亚基H1-H2膜外区结构域的多克隆抗体WJS为工具药，分析其是否参与低浓度哇巴因的正性肌力作用或者特异性作用于α2亚基来寻找更安全的正性肌力作用药物。

1材料与方法

1.1药品与试剂哇巴因由美国Sigma公司提供,用二甲基亚砜溶解配成100 mmol/L的母液,贮存于-20 ℃的冰箱中。WJS(LAAMEDEPSNDNGGGSC)以及该结构域多肽RE2(LAAMEDEPSNDNGGGSC)购自杭州华安生物技术有限公司。台式液：氯化钠(NaCl)140.0 mmol/L,氯化钾(KCl)5.4 mmol/L,氯化镁(MgCl2)1.0 mmol/L,4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPEs)10.0 mmol/L,D-葡萄糖 10.0 mmol/L,氢氧化钠(NaOH)调节pH值至7.4。KB液：氢氧化钾(KOH)80.0 mmol/L，KCl 40.0 mmol/L,磷酸二氢钾(KH2PO4)25.0 mmol/L,硫酸镁(MgSO4)3.0 mmol/L,L-谷氨酸 50.0 mmol/L,牛磺酸(Taurine)20.0 mmol/L,HEPEs 10.0 mmol/L,乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)1.0 mmol/L,D-葡萄糖 10.0 mmol/L,KOH调节pH值至7.2。上述试剂购自Maverick公司。消化液：含0.6%胶原酶B(collagenase B,Roche)，0.6%牛血清清蛋白(bovine serum albumin，BSA,Maverick)，30 μmol/L Ca2+的上述台式液。兔抗鼠钠泵α2亚基多克隆抗体(Santa 公司)；生物素标记的羊抗兔和羊抗鼠 IgG 和辣根酶标记链霉卵白素(北京中杉金桥生物技术有限公司)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(Pierrce)。

本研究创新点：

利用作用在抗心肌钠泵α2亚基H1-H2膜外区结构域的多克隆抗体WJS为工具，在急性分离的大鼠心室肌细胞上，用全细胞膜片钳技术记录钠泵电流(Ip)，观察WJS对哇巴因抑制Ip作用的影响。并用激光共聚焦显微镜测定心室肌细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)的大小及利用细胞动缘探测系统测定心室肌细胞收缩力的大小。通过封闭该结合位点从而有效拮抗哇巴因对钠泵的抑制作用，比较封闭前后哇巴因对心室肌细胞钠泵活性的影响及心室肌细胞收缩力、[Ca2+]i的变化，更深入地揭示钠泵与哇巴因的可能作用机制，结果表明，高亲和力钠泵α2亚基介导哇巴因治疗心力衰竭的作用。使哇巴因强心机制的研究更加深入和全面，既可提高强心苷类药物治疗心力衰竭的安全性，又可开辟寻找心力衰竭治疗药物的新途径。

1.2实验动物2013年1月—2015年1月选用清洁级成年雄性SD大鼠20只，体质量220～250 g，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2012-1-003，动物合格证编号：910022。

1.3单个心室肌细胞的急性分离参照文献[12]采用Langendorff灌流法，大鼠采用1.2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，摘取心脏迅速挂于Langendorff装置上，以无钙台氏液行主动脉逆行灌流，灌流液以纯氧饱和,保温37 ℃左右，灌流速度为5～8 ml/min。2 min后，用含0.33 mg/ml胶原酶的无钙台氏液反复灌流，至心脏变软，取下置于KB液中，剪碎后，用吸管吹打，以200目尼龙网过滤，保留上清液。分离的细胞在KB液中于4 ℃保存备用。实验均灌流给药，在细胞分离后10 h内完成。此法可得到80%呈杆状的成活心室肌细胞。置于室温待用，2 h后选择细胞膜光滑、横纹清晰、贴壁较好、稳定无收缩的心室肌细胞用于实验。

1.4Western blotting法检测WJS的表达水平将心室肌细胞进行常规 Western blotting法检测，10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离蛋白，采用聚偏氟乙烯(PVDF)膜进行半干转膜，一抗为兔抗鼠钠泵α2亚基多克隆抗体，二抗为生物素标记的羊抗兔和羊抗鼠IgG，二氨基联苯胺(DAB)试剂盒显色，Bio-1D 图像分析系统分析显色条带的吸光度。

1.5细胞免疫荧光法检测WJS表达用含5% BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)孵育大鼠心室肌细胞1 h，后用WJS(稀释浓度1∶1 000)与RE2(1 mmol/L)共同室温下孵育1 h，用PBS清洗3遍。细胞以1 μmol/L哇巴因灌流15 min。在激发光波长为495 nm，吸收光波长为520 nm的荧光显微镜下观察免疫荧光细胞。

1.6钠泵电流(Ip)的测定

1.6.1电极内液和细胞外液的配制(1)电极内液：氢氧化铯(CsOH)30 mmol/L,氯化四乙铵(TEACl) 20 mmol/L,MgSO45 mmol/L,HEPEs 5 mmol/L,EGTA 11 mmol/L,葡萄糖10 mmol/L，Na2-ATP 5 mmol/L，氯化钙(CaCl2)1 mmol/L，用CsOH调节pH值至7.2。(2)细胞外液：NaCl 137.7 mmol/L,NaOH 2.3 mmol/L,KCl 5.4 mmol/L，MgCl21 mmol/L，HEPEs 5 mmol/L,葡萄糖10 mmol/L，氯化钡(BaCl2)2 mmol/L，氯化镉(CdCl2)1 mmol/L，用NaOH调节pH值至7.4。

1.6.2Ip的测定采用全细胞膜片钳技术(whole-cell patch-clamp technique)记录Ip，钠泵1次主动转运可将3个Na+泵出细胞外，同时泵进2个K+，因而可产生一个纯净的向外电流。在特定的细胞外液和电极内液阻断细胞膜上其他离子通道和交换体电流的条件下(主要是K+电流、Ca2+电流、Na+/Ca2+交换体电流)，灌流钠泵的抑制剂哇巴因，使膜电流产生内向移动，此差别电流反映Ip大小。用微电极拉制器拉制玻璃微电极，电极入液电阻为2～4 MΩ。将心室肌细胞置于浴槽中，灌流细胞外液2 ml/min，选用条纹清晰的杆状细胞与微电极封接，破膜，待电流平稳后，以钠泵抑制剂哇巴因为工具药由低到高浓度(1 μmol/L和1 mmol/L)进行灌流，采用Axon 700B放大器将细胞膜电位钳制在0 mV，采样率为200 ms/point，记录全细胞Ip。电流密度即是电流大小与电容之比。由于1 mmol/L哇巴因可以引起最大的Ip，所以以1 mmol/L哇巴因引起的电流大小为100% (即Ipt，总泵电流)，计算1 μmol/L哇巴因抑制百分率。因为高亲和力钠泵电流(Iph)表示由钠泵α2亚基介导而低亲和力钠泵电流(Ipl)由钠泵α1亚基介导[13]，据Ipt=Ipl+Iph，所以Ipl可通过1 μmol/L哇巴因阻断Iph后由1 mmol/L哇巴因计算。参照文献[12]，将心室肌细胞分为4组，1 μmol/L哇巴因组、WJS+1 μmol/L哇巴因组、1 mmol/L哇巴因组、WJS+1 mmol/L哇巴因组,每组11个心室肌细胞。1 μmol/L哇巴因组给予哇巴因(1 μmol/L)进行灌流；WJS+1 μmol/L哇巴因组以WJS(稀释浓度1∶1 000)孵育心室肌细胞0.5 h后，再给予哇巴因(1 μmol/L)进行灌流；1 mmol/L哇巴因组给予哇巴因(1 mmol/L)进行灌流；WJS+1 mmol/L哇巴因组以WJS(稀释浓度1∶1 000)孵育心室肌细胞0.5 h后，再给予哇巴因(1 mmol/L)进行灌流。比较Ipl、Iph。

1.7激光共聚焦显微镜检测心室肌细胞游离钙浓度([Ca2+]i)参照文献[12]，将心室肌细胞分为4组，1 μmol/L哇巴因组、WJS+1 μmol/L哇巴因组、1 mmol/L哇巴因组、WJS+1 mmol/L哇巴因组,每组9个心室肌细胞。1 μmol/L哇巴因组给予哇巴因(1 μmol/L)进行灌流；WJS+1 μmol/L哇巴因组以WJS(稀释浓度1∶1 000)孵育心室肌细胞0.5 h后，再给予哇巴因(1 μmol/L)进行灌流；1 mmol/L哇巴因组给予哇巴因(1 mmol/L)进行灌流；WJS+1 mmol/L哇巴因组以WJS(稀释浓度1∶1 000)孵育心室肌细胞0.5 h后，再给予哇巴因(1 mmol/L)进行灌流。结果用相对荧光密度=(FI-FI0)/FI0×100%表示，其中FI0表示用药前的荧光密度，FI表示用药后的荧光密度。所有实验每5 s扫1张，共50～120张。分别记录灌流5、15 min时的结果。

1.8心室肌细胞收缩力检测采用IonOptix单细胞动缘检测系统(IonOptix video-based edge-detection)检测心室肌细胞收缩力。将适量细胞放于浴槽内，给予含1.8 mmol/L Ca2+的氧饱和台氏液灌流10 min，灌流速度1.5 ml/min，通过浴槽两侧铂丝电极给予电压15 V，频率1 Hz，波宽4 ms的持续电刺激，在10×物镜下寻找边缘清晰、收缩良好的细胞，切换40×物镜，IonOptix单细胞动缘检测系统能够对被测细胞进行高速采样并成像于计算机并实时跟踪细胞边缘，实时测定心室肌细胞收缩力。将心室肌细胞分为4组，1 μmol/L哇巴因组、WJS+1 μmol/L哇巴因组、1 mmol/L哇巴因组、WJS+1 mmol/L哇巴因组,每组8个心室肌细胞。1 μmol/L哇巴因组给予哇巴因(1 μmol/L)进行灌流；WJS+1 μmol/L哇巴因组以WJS(稀释浓度1∶1 000)孵育心室肌细胞0.5 h后，再给予哇巴因(1 μmol/L)进行灌流；1 mmol/L哇巴因组给予哇巴因(1 mmol/L)进行灌流；WJS+1 mmol/L哇巴因组以WJS(稀释浓度1∶1 000)孵育心室肌细胞0.5 h后，再给予哇巴因(1 mmol/L)进行灌流。分别记录灌流5、15 min时的结果。

2结果

2.1WJS的鉴定(1)WJS浓度及效价：WJS浓度为1.03 mg/ml，效价为1∶240 000。(2)Western blotting法检测结果显示，纯化后的WJS在电泳时分别出现2条清晰的条带，其分子量均为 110 kD 左右(见图1，本文图1～3彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。说明WJS能够像市售钠泵α2亚基抗体一样特异性辨认钠泵α2亚基 H1-H2 膜外区结构域，能够检测到来自大鼠心室肌细胞的钠泵α2亚基，表明WJS具有抗钠泵α2亚基抗体的性质。(3)细胞免疫荧光法测定结果显示，WJS均结合在心室肌细胞钠泵的膜外区，而且这种结合并不被1 μmol/L哇巴因影响，但却被在H1-H2膜外区特异性抗原点具有相同成分的多肽阻断剂RE2取消(见图2)。

2.2WJS对哇巴因所致Ip的影响当以哇巴因1 μmol/L及1 mmol/L灌流大鼠心室肌细胞时，由于Ip被抑制，可引起膜电流的内向移动；其中1 μmol/L哇巴因主要阻断Iph,1 mmol/L哇巴因可以阻断Ipt。而抗体WJS能基本取消1 μmol/L哇巴因对Iph的抑制。4组Iph、Ipl比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中WJS+1 μmol/L哇巴因组Iph低于1 μmol/L哇巴因组，差异均有统计学意义(P<0.05)；1 mmol/L哇巴因组、WJS+1 mmol/L哇巴因组Iph高于1 μmol/L哇巴因组和WJS+1 μmol/L哇巴因组，Ipl低于1 μmol/L哇巴因组和WJS+1 μmol/L哇巴因组，差异均有统计学意义(P<0.05)；WJS+1 mmol/L哇巴因组Iph高于1 mmol/L哇巴因组，Ipl低于1 mmol/L哇巴因组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.3WJS对哇巴因所致心室肌细胞[Ca2+]i的影响灌流5、15 min 4组心室肌细胞[Ca2+]i比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中灌流5、15 min WJS+1 μmol/L哇巴因组心室肌细胞[Ca2+]i低于1 μmol/L哇巴因组，差异均有统计学意义(P<0.05)；灌流5、15 min 1 mmol/L哇巴因组、WJS+1 mmol/L哇巴因组心室肌细胞[Ca2+]i高于1 μmol/L哇巴因组和WJS+1 μmol/L哇巴因组，差异均有统计学意义(P<0.05)；灌流5、15 min WJS+1 mmol/L哇巴因组心室肌细胞[Ca2+]i高于1 mmol/L哇巴因组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2、图3)。

2.4WJS对哇巴因所致心室肌细胞收缩力的影响灌流5、15 min 4组心室肌细胞收缩力比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中灌流5、15 min WJS+1 μmol/L哇巴因组心室肌细胞收缩力低于1 μmol/L哇巴因组，差异均有统计学意义(P<0.05)；灌流5 min1 mmol/L哇巴因组、WJS+1 mmol/L哇巴因组心室肌细胞收缩力高于1 μmol/L哇巴因组和WJS+1 μmol/L哇巴因组，灌流15 min心室肌细胞收缩力低于1 μmol/L哇巴因组和WJS+1 μmol/L哇巴因组，差异均有统计学意义(P<0.05)；灌流5、15 min WJS+1 mmol/L哇巴因组心室肌细胞收缩力低于1 mmol/L哇巴因组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3、图4)。

图1　Western blotting法检测WJS表达水平

图2　细胞免疫荧光法检测WJS表达

组别例数IphIpl1μmol/L哇巴因组110.14±0.010.28±0.02WJS+1μmol/L哇巴因组110.04±0.01a0.29±0.011mmol/L哇巴因组110.20±0.02ab0.16±0.01abWJS+1mmol/L哇巴因组110.22±0.01abc0.14±0.01abcF值387.10410.67P值<0.001<0.001

注：Iph=高亲和力钠泵电流,Ipl=低亲和力钠泵电流；与1 μmol/L哇巴因组比较，aP<0.05；与WJS+1 μmol/L哇巴因组比较，bP<0.05；与1 mmol/L哇巴因组比较，cP<0.05

Table 2Comparison of [Ca2+]i among the four groups at different time points

组别例数5min15min1μmol/L哇巴因组9189.5±14.0183.2±8.9WJS+1μmol/L哇巴因组9151.4±6.7a157.1±7.8a1mmol/L哇巴因组9246.6±11.2ab268.3±12.3abWJS+1mmol/L哇巴因组9232.3±10.5abc230.2±11.5abcF值140.73207.46P值<0.001<0.001

注：与1 μmol/L哇巴因组比较，aP<0.05；与WJS+1 μmol/L哇巴因组比较，bP<0.05；与1 mmol/L哇巴因组比较，cP<0.05

3讨论

CGs药物是治疗心力衰竭的传统经典药物，其增加心肌收缩性的机制一直被认为在于其抑制钠泵，而CGs药物在心力衰竭患者的治疗浓度却远低于其在体外抑制钠泵的浓度，因此治疗浓度CGs药物的正性肌力作用可能与钠泵抑制作用并无因果关系，甚至此治疗浓度反而兴奋钠泵，这使得钠泵抑制理论难以圆满解释治疗浓度CGs药物的强心作用。钠泵是普遍存在于人类和动物细胞膜上的一种酶，其α亚基上存在CGs药物的结合位点。心室肌细胞钠泵不同亚型是CGs药物治疗心力衰竭中发挥治疗和不良反应的重要影响因素[9-10]。文献报道，钠泵特别是抑制α2亚基调节着哇巴因诱导的心室肌细胞收缩力，而抑制α1亚基则会造成钙超载和非节律性收缩[11]，这为在治疗心力衰竭过程中寻找特异性作用于α2亚基的药物提供参考思路。有研究发现，临床上CGs药物有效治疗心力衰竭的血清游离药物浓度(10-9～10-8mol/L)比体外细胞实验抑制钠泵的浓度低得多[12]。本课题组前期的实验发现，低浓度CGs药物的正性肌力作用与钠泵的离子泵功能无关，可能仅涉及了钠泵的信号转导功能[13]。因此，目前关于哇巴因的正性肌力作用有两种可能机制：高浓度哇巴因抑制钠泵α1亚基即低亲和力泵，且其增强心室肌细胞收缩力的作用与泵的抑制程度呈正相关；低浓度即治疗浓度下的哇巴因与钠泵的α2亚基即高亲和力泵有关，且其加强心室肌细胞收缩力作用与钠泵的离子转运功能无关，可能与其他如信号转导功能有关[14]。

图3　WJS对哇巴因所致心室肌细胞[Ca2+]i的影响

Table 3Comparison of contractility of myocardial cells among the 4 groups at different time points

组别例数5min15min1μmol/L哇巴因组8141.8±7.9142.1±6.2WJS+1μmol/L哇巴因组8103.9±2.8a118.1±6.9a1mmol/L哇巴因组8283.9±12.1ab101.5±3.2abWJS+1mmol/L哇巴因组8238.6±11.2abc85.2±3.9abcF值651.62169.46P值<0.001<0.001

注：与1 μmol/L哇巴因组比较，aP<0.05；与WJS+1 μmol/L哇巴因组比较，bP<0.05；与1 mmol/L哇巴因组比较，cP<0.05

图4　WJS对哇巴因所致心室肌细胞收缩力的影响

Figure 4Effect of WJS on the contractility of myocardial cells induced by uabain

鉴于以上研究，本研究将实验分3部分。首先，以α2亚基H1-H2膜外区结构域氨基酸序列作为靶蛋白，通过免疫动物获得抗血清制备多克隆抗体WJS，通过此抗体来封闭哇巴因与钠泵α2亚基H1-H2膜外区结构域结合位点，为进一步探讨钠泵与其抑制因子的可能作用机制奠定了基础。实验结果显示，WJS能够选择性与心室肌细胞钠泵α2亚基H1-H2膜外区结构域结合，并与钠泵α2亚基H1-H2膜外区结构域抗原点相互作用。其次，利用该抗体封闭钠泵α2亚基膜外区结构域上的哇巴因结合位点，拮抗或阻断钠泵抑制因子对钠泵的抑制作用，通过比较封闭前和封闭后哇巴因对钠泵的活性影响、Ip的变化，更深入地揭示钠泵与其抑制因子的可能作用机制，为心力衰竭的治疗提供理论和实验依据，同时试图发现可更有效治疗心力衰竭的新型药物。实验结果显示，预孵抗体WJS能基本取消低浓度哇巴因对Iph的抑制，说明WJS可以与钠泵α2亚基H1-H2膜外区结构域的该位点作用，从而减少高亲和力泵的活性。最后，进一步对心室肌细胞[Ca2+]i、心室肌细胞收缩力相关因素进行探讨，检测其是否参与了治疗浓度哇巴因的正性肌力作用。实验结果显示，钠泵α2亚基H1-H2膜外区结构域参与哇巴因增加心室肌细胞收缩力的作用，提示钠泵α2亚基介导了哇巴因的治疗作用，对于更深入地揭示钠泵的功能和作用机制以及为临床治疗心力衰竭药物的研制提供新的线索。

总之，本实验利用钠泵膜外区特异性的抗体，从细胞、分子水平比较封闭前后哇巴因对钠泵功能的影响及可能作用的机制。明确该膜外区参与哇巴因正性肌力作用的机制，为临床治疗心力衰竭采用新的治疗手段提供了新途径，同时也为研发高效低毒的药物提供一全新的治疗思路。

作者贡献：武彦昭进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；张兰进行实验实施、评估、资料收集；熊晨进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

参考文献

[1]Reddy S,Benatar D,Gheorghiade M.Update on digoxin and other oral positive inotropic agents for chronic heart failure[J].Curr Opin Cardiol，1997,12(3):233-241.

[2]Bers DM.Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes[J].Annu Rev Physiol，2008,70(1):23-49.

[3]Crambert G,Hasler U,Beggah AT,et al.Transport and pharmacological properties of nine different human Na,K-ATPase isozymes[J].J Biol Chem,2000,275(3):1976-1986.

[4]Kaplan JH.Biochemistry of Na,K-ATPase[J].Annu Rev Biochem,2002,71(1):511-535.

[5]Mobasheri A,Avila J,Cózar-Castellano I,et al.Na+,K+-ATPase sozyme diversity;comparative biochemistry and physiological implications of novel functional interactions[J].Biosci Rep,2000,20(2):51-91.

[6]Wang J,Velotta JB,McDonough AA,et al.All human Na(+)-K(+)-ATPase alpha-subunit isoforms have a similar affinity for cardiac glycosides[J].Am J Physiol Cell Physiol,2001,281(4):C1336-1343.

[7]Biser PS,Thayne KA,Fleming WW,et al.Na+,K+ATPase alpha-subunit isoform distribution and abundance in guinea-pig longitudinal muscle/myenteric plexus after exposure to morphine[J].Brain Res,2002,931(2):186-193.

[8]Price EM,Lingrel JB.Structure-function relationships in the Na,K-ATPase alpha subunit:site-directed mutagenesis of glutamine-111 to arginine and asparagines-122 to aspartic acid generates a ouabain-resistant enzyme[J].Biochemistry,1988,27(22):8400-8408.

[9] Lingrel JB.The physiological significance of the cardiotonic steroid/ouabain-binding site of the Na,K-ATPase[J].Annu Rev Physiol,2010,72:395-412.

[10]Swift F,Tovsrud N,Enger UH,et al.The Na+/K+-ATPase alpha2-isoform regulates cardiac contractility in rat cardiomyocytes[J].Cardiovasc Res,2007,75(1):109-117.

[11]Adams RJ,Schwartz A,Grupp G，et al.High-affinity ouabain binding site and low-dose inotropic effect in rat myocardium[J].Nature，1982，296(5853):167-169.

[12]Noble D.Mechanism of action of therapeutic levels of cardiac glycosides[J].Cardiovasc Res，1980,14(9):495-514.

[13]Gao J,Wymore RS,Wang Y,et al.Isoform-specific stimulation of cardiac Na/K pumps by nanomolar concentrations of glycosides[J].J Gen Physiol,2002,119(4):297-312.

[14]Katz A,Lifshitz Y,Bab-Dinitz E,et al.Selectivity of digitalis glycosides for isoforms of human Na,K-ATPase[J].J Biol Chem,2010,285(25):19582-19592.

(本文编辑：陈素芳)

【关键词】肌细胞,心脏；哇巴因；钠钾交换ATP酶；大鼠

武彦昭,张兰，熊晨.钠泵α2亚基介导低浓度哇巴因影响大鼠心室肌细胞收缩力的作用研究[J].中国全科医学，2016，19(3)：285-291.[www.chinagp.net]

Wu YZ,Zhang L,Xiong C.Effect of sodium pump α2 subunit mediating low-concentration ouabain on the contractility of rat myocardial cells[J].Chinese General Practice，2016，19(3)：285-291.

Effect of Sodium Pump α2 Subunit Mediating Low-concentration Ouabain on the Contractility of Rat Myocardial CellsWUYan-zhao,ZHANGLan,XIONGChen.TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

【Abstract】BackgroudThe application of CGs has much limitation in the treatment of heart failure due to its therapeutic window.Myocardial sodium pump is the target spot of the drug effect of CGs,while the mechanism of the interaction between CGS and sodium pump needs further elaboration.The first extramembrane fragment H1-H2 is currently considered as a possible binding site for ouabain (OUA).ObjectiveThe polyclonal antibody WJS which has effect on the extramembrane fragment H1-H2 of anti-myocardial sodium pump α2 subunit was employed,and the binding site was closed,which had effective antagonism on ouabain′s inhibiting effect on sodium pump.Comparison was made in the influence of ouabain on the activity of sodium pump of myocardial cells,cell contractility and the variation of intracellular calcium,and the effect mechanism of sodium pump and ouabain was investigated.MethodsThe ventricle muscle cells of rates were acutely isolated from January 2013 to January 2015 and were divided into four groups:1 μmol/L ouabain group,WJS+1 μmol/L ouabain group,1 mmol/L ouabain group and WJS+1 mmol/L ouabain group.The 1 μmol/L ouabain group was given 1 μmol/L ouabain by perfusion;the WJS+1 μmol/L group was given ouabain after incubating myocardial cell by antibody WJS (diluted concentration 1∶1 000);the 1 mmol/L ouabain group was given 1 mmol/L ouabain by perfusion;the WJS+1 mmol/L ouabain group was given 1 mmol/L ouabain by perfusion after incubating myocardial cells for 0.5 hour by antibody WJS (diluted concentration 1∶1 000).Sodium pump current was recorded using whole-cell patch clamp technique,and the influence of WJS on the inhibiting effect of ouabain on Ip was observed;laser scanning confocal microscope was used to determine the concentration of free calcium([Ca2+]i) of myocardial cells;video-based motion edge-detection system was employed to measure the length of myocardial cells and the magnitude of contractility.ResultsThe results of western blotting showed that two clear stripes showed in the electrophoresis of WJS after purification,with a molecular weight of 110 kD each.The results of cell immunofluorescence method showed that WJS all bonding in the extramembrane fragment of the sodium pump of myocardial cells;the bonding was not influenced by 1 μmol/L ouabain but was undone by polypeptide blockers of RE2 with the same components at the specific antigen cutoff point in the extramembrane fragment H1-H2.The WJS+1 μmol/L ouabain group was lower than the 1 μmol/L ouabain group in the high-affinity sodium pump current(Iph)(P<0.05);the 1 mmol/L ouabain group and the WJS+1 mmol/L ouabain group were higher in Iph and lower in low-affinity sodium pump current(Iph)than the 1 μmol/L ouabain group and the WJS+1 μmol/L ouabain group (P<0.05);the WJS+1 mmol/L ouabain group was higher in Iph and was lower in Ipl than the 1 mmol/L ouabain group (P<0.05 for all).The WJS+1 μmol/L ouabain group was lower than the 1 μmol/L ouabain group in 5 min and 15 min [Ca2+]i in myocardial cells (P<0.05);the 1 mmol/L ouabain group and the WJS+1 mmol/L ouabain group were higher than the 1 μmol/L ouabain group and the WJS+1 μmol/L ouabain group in 5 min and 15 min [Ca2+]i in myocardial cells (P<0.05);the WJS+1 mmol/L group was higher than the 1 mmol/L ouabain group in 5 min and 15 min [Ca2+]i in myocardial cells (P<0.05).The WJS+1 μmol/L ouabain group was lower than the 1 μmol/L ouabain group in 5 min and 15 min contractility of myocardial cells (P<0.05);1 mmol/L ouabain group and WJS+1 mmol/L ouabain group were higher in 5 min contractility and lower in 15 min contractility of myocardial cells than 1 μmol/L ouabain group and WJS+1 μmol/L ouabain group (P<0.05);the WJS+1 mmol/L ouabain group was higher in 5 min contractility of myocardial cells and was lower in 15 min contractility of myocardial cells than 1 mmol/L ouabain group (P<0.05).ConclusionThe polyclonal antibody WJS in the H1-H2 extramembrane fragment of anti-myocardial sodium pump α2 subunit could undo the high-affinity sodium pump currency and the reinforcement of the contractility of myocardial cells induced by low-concentration uabain,which indicates the therapeutic effect of sodium pump α2 aubunit mediating low-concentration ouabain.

【Key words】Myocytes,cardiac；Ouabain；Sodium-potassium-exchanging ATPase；Rats

(收稿日期：2015-05-06；修回日期：2015-10-27)

【中图分类号】R 541.6

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.03.009

通信作者：熊晨，050017河北省石家庄市，河北医科大学药理教研室；E-mail:bearmorning@sina.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81302773)；河北省自然科学基金资助项目(H2014206319)
作者单位：050011河北省石家庄市，河北医科大学第四医院(武彦昭,张兰)；河北医科大学药理教研室(熊晨)