三波长分光光度法快速测定青苹果中的苹果酸

庞向东 江 虹 张 琴 蒋天艳

(1. 长江师范学院化学化工学院，重庆 408100； 2. 重庆市无机特种功能材料重点实验室，重庆 408100)

三波长分光光度法快速测定青苹果中的苹果酸

庞向东1,2江 虹1,2张 琴1,2蒋天艳1,2

(1. 长江师范学院化学化工学院，重庆 408100； 2. 重庆市无机特种功能材料重点实验室，重庆 408100)

为建立快速测定青苹果中苹果酸的三波长分光光度法，利用孔雀石绿能在弱酸性的Tris—盐酸缓冲溶液中与苹果酸反应，在可见光区生成具有3个明显正吸收峰(分别位于 568，644，424 nm 波长处)的绿色离子缔合物，对用三波长法测定苹果酸进行了研究，并考察了适宜的反应条件及吸收光谱特征。结果表明，用三波长叠加法测定，表观摩尔吸光系数(κ)为5.88×104L/(mol·cm)，苹果酸的质量浓度在0.008～1.900 mg/L 时服从朗伯—比尔定律，定量限为 0.003 2 g/100 g，样品加标回收率为98.23%～102.9%，相对标准偏差为1.8%～2.4%。该法可用于青苹果中苹果酸的测定。

青苹果；苹果酸；孔雀石绿；三波长；分光光度法

苹果酸在改善记忆功能、预防老年性痴呆、增强钙的活性及降低抗癌药物毒副作用等方面具有一定价值[1]。目前，苹果酸含量的测定方法主要有：高效液相色谱法[2-4]、气相色谱法[5]、液质联用法[6-7]和电化学法[8-9]等。高效液相色谱法仪器价格昂贵，且前处理繁琐、费时；气相色谱法的前处理也较繁琐；电化学法的重现性较差。由于紫外—可见分光光度法仪器价廉，操作简便，且未见利用三波长可见分光光度法进行苹果酸测定的报道。因此，本研究拟以三苯甲烷类染料孔雀石绿为探针，在弱酸性溶液中，采用三波长可见分光光度法测定苹果酸的含量，旨在建立一种青苹果中苹果酸的快速测定方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

紫外—可见—近红外分光光度计：U-4100型，日本日立公司；

精密酸度计：pHS-3C型，上海虹益仪器仪表有限公司；

电子天平：EL104型，上海梅特勒—托利多仪器有限公司；

青苹果：1#～4#，购自重庆4个农贸市场；

三羟甲基氨基甲烷：分析纯，齐一生物科技(上海)有限公司；

盐酸：分析纯，重庆华东化工有限公司；

孔雀石绿：生物染色剂，上海试剂三厂；

苹果酸：分析纯，重庆药品食品检定所；

试验用水：二次蒸镏水。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制

(1) 孔雀石绿(malachite green，MAG)溶液：1.0×10-3mol/L。称取适量孔雀石绿于小烧杯中，用水溶解后，转移至500 mL 容量瓶中，用水定容。

(2) 苹果酸(malic acid，MAL)标准溶液：134.1 mg/L 贮备液。称取适量苹果酸于小烧杯中，用水溶解后转移至100 mL 容量瓶中，用水稀至刻度，冰箱4 ℃ 保存。使用时用水稀释10倍。

(3) Tris(三羟甲基氨基甲烷)—盐酸缓冲溶液：用0.20 mol/L Tris溶液与0.10 mol/L盐酸混合，用酸度计测定，配成 pH 3.0～9.6的系列缓冲溶液。

1.2.2 样品的处理 取青苹果1#～4# 各多个，削皮，去核，榨汁。准确称取搅拌均匀的 1# 果汁5.062 3 g，2# 果汁 5.023 6 g，3# 果汁 5.017 4 g 和4# 果汁 5.025 5 g，过滤，滤液分别置于1 000 mL容量瓶中，用水定容，摇匀，即得待测液。

1.2.3 测定波长及pH 值的选择 取11 支10 mL 具塞比色管，分别准确加入13.41 mg/L 苹果酸标准溶液1.0 mL和1.0×10-3mol/L 孔雀石绿溶液2.0 mL，再分别加入pH 值为3.09，3.56，4.07，4.35，5.03，5.49，5.86，6.15，6.45，6.85，7.58 的Tris—盐酸缓冲溶液1.0 mL，用水稀至10 mL 刻度，摇匀，用1 cm 比色皿，以试剂空白作参比，扫描吸收光谱。根据光谱图，确定测定波长。再根据吸收峰处的吸光度A，作吸光度—pH 曲线图，确定缓冲溶液的最佳pH 值。

1.2.4 缓冲溶液用量的选择 在标准溶液和显色剂溶液浓度不变的情况下，分别加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL 1.2.3 节选定的pH 值，并按1.2.3 节的方法扫描吸收光谱，作吸光度—缓冲液用量的曲线图，确定最佳缓冲液的用量。

1.2.5 显色剂溶液浓度的选择 在其它条件不变的情况下，改变1.0×10-3mol/L 孔雀石绿溶液的用量，再按1.2.3 节方法扫描吸收光谱，作吸光度—显色剂溶液浓度曲线图，确定最佳显色剂溶液的浓度。

1.2.6 加入顺序的选择 在上述选定的条件下，改变各试剂的加入顺序，按1.2.3 节方法扫描吸收光谱，根据光谱曲线图，确定最佳加入顺序。

1.2.7 测定时间的选择 在上述选定的条件下，扫描不同时间(t)下的吸收光谱，作吸光度—反应时间曲线图，确定最佳测定时间。

1.2.8 标准曲线的制作 在选定的显色剂浓度、pH 值、用量及顺序的条件下，分别加入13.41 mg/L苹果酸标准溶液0.2，0.6，1.0，1.4 mL，再用水稀至刻度，摇匀，在选定的时间下，用1 cm比色皿，以试剂空白作参比，按选定条件扫描吸收光谱，根据测定波长下的吸光度及苹果酸的质量浓度，绘制吸光度—苹果酸质量浓度标准曲线。

1.2.9 共存物质的影响 在选定的条件下，加入1.0 mL 13.41 mg/L 苹果酸标准溶液，按1.2.3 节方法配制溶液并扫描吸收光谱；另取若干支10 mL 具塞比色管，在前述溶液的基础上，分别加入需考察的共存物质，再按选定条件扫描吸收光谱，并与未加共存物质的谱线比较，判断共存物质是否干扰苹果酸的测定。

1.2.10 样品中苹果酸的测定 取1.2.2 节中的待测样液适量，按选定的条件加入显色剂及缓冲溶液，用水稀至10 mL 刻度，摇匀，按选定条件扫描吸收光谱，根据样品的吸光度及标准曲线或回归方程，求得样液中苹果酸的含量，再求出原始样液中苹果酸的含量。各平行测定6份，同时做加标回收试验(n=6)。

2 结果与讨论

2.1 反应体系的吸收光谱特征

图1为MAG—MAL 体系的吸收光谱图。由图1可知，苹果酸在可见光区几乎无吸收；孔雀石绿在可见光区有较强吸收，最大吸收波长为616 nm；在孔雀石绿的弱酸性溶液中加入苹果酸标准溶液后，因孔雀石绿为碱性染料，可与苹果酸以静电引力作用生成二元离子缔合物，使可见光区内的光谱曲线上出现3个较强的吸收峰，最大吸收峰位于568 nm，次大吸收峰位于644 nm，相对最小的吸收峰位于424 nm。在此3个波长处，一定浓度范围的苹果酸的质量浓度与二元缔合物的吸光度呈良好的线性关系。根据吸光度的加和性，用三波长叠加法测定时，一定浓度范围的苹果酸的质量浓度与体系的吸光度仍呈线性关系，并服从朗伯—比尔定律，且方法的灵敏度5.88×104L/(mol·cm)，是单波长法测定的2.5～4.0 倍。故选择用三波长法定量检测苹果酸的含量。

图1 吸收光谱

2.2 反应条件的优化

2.2.1 pH 值 由图2可知：在pH 5.5～6.8时，缔合物在644，568，424 nm 波长处的吸光度均较大，且基本处于一个平台上，这表明反应的适宜pH 范围为5.5～6.8，在此范围外，缔合物的吸光度均有不同程度降低。当采用三波长法测定时，因三波长处的吸光度叠加值比单波长大，灵敏度更高。因此选择用pH 6.15 的Tris—盐酸缓冲溶液。继而固定其它条件不变，改变pH 6.15 的用量，结果表明：适宜用量为1.5 mL。

图2 pH值对吸光度的影响

2.2.2 显色剂溶液的浓度 由图3可知：当孔雀石绿溶液浓度为2.5×104mol/L 时，缔合物在644，568，424 nm 波长处的吸光度值均较大，当用三波长法测定时，其三波长叠加吸光度比单波长更大，灵敏度更高。故试验用2.5 mL 1.0×103mol/L 孔雀石绿溶液。

图3 孔雀石绿溶液的浓度对吸光度的影响

2.2.3 试剂加入顺序 由表1可知，在选定条件下，当加入顺序为Tris—盐酸缓冲溶液、孔雀石绿溶液、苹果酸标准溶液时，缔合物在644，568，424 nm波长处的吸光度值相对最大，当用三波长法测定时，其三波长叠加吸光度更大，灵敏度更高。故试验按此最佳顺序进行。

表1 试剂加入顺序对吸光度的影响

2.2.4 反应时间及缔合物的稳定性 由图4可知，开始时，缔合物的吸光度随时间的增加而逐渐增大，至20 min后，吸光度值基本不变。这说明苹果酸与孔雀石绿的显色反应在20 min 内即可完成，生成的缔合物稳定时间至少1 h。故试验选在 20 min后测定。

图4 反应时间对吸光度的影响

2.3 标准曲线

于10 mL 具塞比色管中，准确加入pH 6.15 Tris—盐酸缓冲溶液1.5 mL和1.0×10-3mol/L 孔雀石绿溶液2.5 mL，再加入适量的 13.41 mg/L 苹果酸标准溶液，用水稀至刻度，摇匀，20 min后，用1 cm 比色皿，以试剂空白作参比，采用三波长(644，568，424 nm)叠加法测定溶液的吸光度A。作吸光度—苹果酸质量浓度标准曲线见图5。由图5可知，苹果酸的质量浓度在0.008～1.900 mg/L时量与缔合物的吸光度呈线性关系，服从朗伯—比尔定律。该方法的一元线性回归方程为A=-0.001 03+0.439 1ρ，相关系数r=0.999 9，根据朗伯—比尔定律可求得表观摩尔吸光系数为5.88×104L/(mol·cm)，再根据式(1)求出方法的定量限为 0.003 2 g/100 g。

(1)

式中：

Q——定量限，μg/g；

sb——多次测定的空白信号的标准偏差；

S——分析方法的灵敏度，μg-1；

m——样品的质量，g。

图5 苹果酸的标准曲线

2.4 共存物质的影响

2.5 分析应用

取1.2.2 节中的待测样液各 0.5 mL，按最佳试验条件配制溶液，并扫描吸收光谱。根据三波长法的标准曲线或回归方程求得样液及原始样液中苹果酸的含量，同时做加标回收试验。测定结果与HPLC法(GB/T 5009.157—2003)对照，结果见表2。

表2 样品分析结果及回收试验

由表2可知，回收率为98.23%～102.9%，相对标准偏差为1.8%～2.4%，表明本方法具有较高的准确度和精密度，测定结果与国标法基本一致。

3 结论

本试验建立了测定青苹果中苹果酸的三波长吸收光谱法。该法具有简便、快速的特点，并有较高的准确度和精密度，可用于系列苹果中苹果酸的测定。但也存在灵敏度不很高的问题，有待对三元体系进行进一步研究。

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Fast ddetermination of malic acid in greenapple by three-wavelength spectrophotometry

PANG Xiang-dong1,2JIANGHong1,2ZHANGQin1,2JIANGTian-yan1,2

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,YangtzeNormalUniversity,Chongqing408100,China; 2.ChongqingKeyLaboratoryofInorganicSpecialFunctionalMaterials,Chongqing408100,China)

A triple wavelength spectrophotometry to measure malice acid in green apples was established in this study. The reaction between malic acid and tris-hydrochloric acid buffer solution of malachite green showed that a green ionic association complex with three positive absorption peak locating in 568 nm, 644 nm and 424 nm, respectively, could be found in visible light generated area. Moreover, the malic acid with triple wavelength spectrophotometry and its related reaction condition and absorption spectral character were investigated. The result showed that the molar absorption coefficient of performance was 5.88×104L/(mol·cm), and the quality concentration of malic acid was found to be 0.008～1.900 mg/L, conforming to Lambert-Beer's Law. It was also found that the limit of quantitation was 0.003 2 g/100 g, and the adding standard recovery rate was 98.23% to 102.9%, with a relative standard deviation at 1.8%～2.4%. This method could be used for the determination of malic acid in green apple.

green apple; malic acid; malachite green; three-wavelength; spectrophotometry

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.017

重庆市教委科技基金资助项目(编号：KJ1401226); 长江师范学院科技基金资助项目(编号：2015CXX080)

庞向东，男，长江师范学院副教授。

江虹(1956—)，女，长江师范学院教授。 E-mail: jianghongch@163.com

2016-09-06