PCR反应体系的设计及优化

◆纪朋艳

PCR反应体系的设计及优化

◆纪朋艳

PCR是分子生物学中常用的实验技术手段，在揭示生命现象规律方面发挥了至关重要的作用。目前在进行PCR实验操作时，因为PCR反应体系设计不合理而导致实验失败的事例较多。因此，从优化PCR反应体系的角度出发，对提高PCR反应效率进行探讨。

PCR；反应体系；实验

1 标准PCR反应体系

标准的PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）反应体系由缓冲液、脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、引物、DNA模板等构成[1]，每个部分在PCR反应中都有重要的作用，并且在合适的浓度范围内才能促进PCR反应的正常进行。

2 PCR反应体系设计

模板核酸DNA模板是PCR反应复制的原始基础，模板质量的优劣，直接决定了整个PCR反应的成败。目前DNA提取方法主要有酚氯仿、高盐法及各试剂公司的试剂盒。酚氯仿作为传统经典的方法，一直受到科研工作者的青睐，其DNA提取质量与纯度较高，但是缺点是程序繁琐、提取效率低。目前在一些样品比较大的实验中，主要采用高盐法提取DNA。试剂盒提取DNA效率与质量都较好，但是费用较高。在PCR反应体系中，一般加入模板的质量为50～100 ng，加入模板的量过多，或产生较多的杂质，出现很多非特异性产物；如果加入的模板较少，产生的特异性产物较少，在检测过程中不易检测。

DNA聚合酶DNA聚合酶是PCR反应中将游离的散乱的碱基按照模板中碱基的顺序，连接于DNA双链中的粘合剂。目前DNA聚合酶主要有两种类型：一种是从水生杆菌中提取的天然聚合酶；另一种是利用大肠杆菌人工合成的基因工程酶。由于当前分子生物学的迅速发展，人工合成的基因工程酶越来越多地得到应用，在20 μl PCR反应体系中，所需要的DNA聚合酶一般为2.5个单位。加入的NDA聚合酶过多，会引起很多非特异性扩增，产生没有用途的非特异性产物；相反，如果加入的DNA酶过少，则会减少特异性产物的产量。

脱氧核苷三磷酸（dNTP）dNTP是合成DNA的原料，主要是4种碱基。dNTP是以干粉状态保存的，在进行分子实验时，需要利用缓冲液溶液和调节pH值，并且小量分装，保存在-20 ℃冰箱中。尽量减少反复冻融的次数，在PCR反应中dNTP的浓度一般在50～200 μmol/L范围内。注意4种dNTP的浓度要相等，如果任何一种dNTP的浓度过低，产生错配的几率将会大大增大；如果dNTP的整体浓度过低，则会降低PCR反应中特异性产物的量；如果dNTP量过高，则会与Mg2+结合，降低Mg2+的浓度。

引物引物中碱基与模板DNA互补的程度，决定了PCR产物的特异性，这也是PCR特异性扩增反应的关键环节。在设计引物序列时，一般遵循以下几个原则：

1）引物的长度一般在15～30 bp之间，20 bp为最优，过短或者过长都不利于PCR的特异性反应；

2）引物的扩增跨度在200～500 bp为好，在特定情况下也可以将扩增片段增至10 kbp；

3）引物的4种碱基中，3′端含有G或者C可以提高引物的特异性，G、C的含量在40%～60%为好，太少或者太多都不利于扩增；

4）引物之间要避免碱基的互补，否则会出现发夹结构，这种二级结构阻止引物与模板的复性结合；特别要注意的是，引物之间不能有连续4个以上的碱基互补，否则产生的非特异性扩增条带会增多；

5）引物的最末及倒数第二个碱基要严格配对，避免引物末端碱基不配对而导致PCR的失败；

6）引物的序列与数据库中其他序列应无明显同源性，在引物中可以加上合适的酶切位点，有利于酶切分析和分子克隆。

Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的产量和特异性有显著的影响。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200 μmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低，会降低DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

3 PCR反应体系的优化

反应体积的优化PCR反应体积一般采用的范围为20～100 μl，常采用的为20 μl、30 μl、50 μl、100 μl。具体在实验中采用哪种反应体系，要根据实验的目的和实验条件来决定。参考已公开的PCR反应体积，进行不同体积的PCR反应，各组分的质量和浓度不能单纯地扩大或者减小，一定要根据实验PCR扩增效果进行摸索，减少或者增加个别组分的质量浓度，最终得到合适的PCR反应体系[2]。

引物扩增效率的优化引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度存在问题，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对此提出以下对策：

1）选定一个好的引物合成单位；

2）引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致（如果一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决；如果一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度）；

3）引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融，或因长期放冰箱冷藏而导致引物变质，降解失效；

4）避免引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

PCR反应条件的优化PCR的反应条件主要是温度、时间及循环次数。温度主要是按照PCR的三个步骤“变性—退火—延伸”设置的。一般的PCR反应，DNA变性温度为90～95 ℃，退火温度为40～60 ℃，延伸温度为70～75 ℃；但是在实际PCR反应中，温度与时间的设置是统一在一起进行的。一般来讲，在93～94 ℃时，1 min便可以使DNA变性；若低于93 ℃，设置的时间需要长一些；但是过高的温度会影响DNA聚合酶的活性。因此，退火温度与时间的设置一般在93～94 ℃时1 min。

退火温度、时间的设置决定于引物的长度、碱基、浓度及其目的片段的长度。可参考以下公式选择合适的温度[3]：

Tm值（解链温度）=4(G+C)+2(A+T)

复性温度=Tm值-(5～10 ℃)

一般来讲，在解链温度允许的范围内，较高的复性温度可以提高PCR反应的特异性，复性时间一般在30～60 s，足可以保证引物的模板的充分结合。

PCR的延伸温度一般设置在70～75 ℃，常用为72 ℃，过高或者过低的温度都不利于引物与模板的结合。PCR的延伸时间是由扩增片段的大小决定的，1 kb以内的DNA片段，延伸时间在1 min左右；3～4 kb的扩增片段，延伸时间在3～4 min；10 kb则需要延伸10 min以上。

循环次数决定了整个PCR的扩增程度，一般设计在30～40次之间为好。设计次数过少，目的片段产物过低，不容易检测；扩增次数过多，产生的非特异性产物也增多，对目的片段的检测产生干扰。

PCR反应各组分浓度的优化PCR中Mg2+、引物及dNTP三种组分的浓度对扩增反应的影响较大。在对PCR反应进行优化的情况下，可根据数据库上的相关文献，参考已经发表的其他反应体系组分，对Mg2+、引物及dNTP的组分设置一系列的浓度，必要时可根据设置浓度的多少，进行正交试验设计[4]，利用同一个DNA样品进行相同程序下的扩增，根据目的片段的量的多少，确定哪种组分组合是最优的PCR反应组合。

PCR产物的检测对PCR产物的检测效果可以对整个PCR反应体系进行优化，如在PCR扩增产物中检测出涂抹带或地毯样带，其主要原因为加入的酶的质量过多、dNTP浓度过高、Mg2+浓度过高、退火温度过低、循环次数过多等。根据这个原因，对PCR反应的各个组分的浓度进行调整，可以提高PCR的反应效率。

[1]田艳伶,李志辉,杨振华,等.钩粟ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J].中南林业科技大学学报,2015(4):11-15.

[2]王小燕,叶祖云,等.正交设计优化太子参ISSR-PCR反应体系[J].邵阳学院学报:自然科学版,2015(6):23-25.

[3]陈升侃,项东云,邓紫宇,等.粗皮桉ISSR-PCR反应体系优化[J].桉树科技,2015(3):45-48.

[4]苏辉,李志刚,宋书宏.正交设计优化大豆SSR-PCR反应体系及引物筛选[J].华北农学报,2009(4):23-27.

Design and Optimization of PCR Reaction System

JI Pengyan

Polymerase Chain Reaction (PCR) technology is commonly used in molecular biology experiments,which played a vital role in terms of reveals life phenomenon law. Now in the PCR laboratory procedures,more and more PCR experiment were failure examples because the not reasonable design PCR reaction system. Therefore,this article discussed the perspective of the PCR reaction system to improve the eff ciency of the PCR reaction.

Polymerase Chain Reaction;reaction system;experiment

G642.423

B

1671-489X(2016)02-0160-02

作者：纪朋艳，吉林医药学院医学实验中心（132013）。

10.3969 /j.issn.1671-489X.2016.02.160