用复合诱导型骨修复材料修复兔桡骨缺损的实验研究

李 根 甄 平 成满平 赵红斌

(兰州军区兰州总医院，兰州 730050)

用复合诱导型骨修复材料修复兔桡骨缺损的实验研究

李 根 甄 平 成满平 赵红斌*

(兰州军区兰州总医院，兰州 730050)

以不同的载药方式构建4种壳聚糖/聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯(PHBV)复合诱导型骨修复材料，检测并比较4种支架材料对兔桡骨缺损的修复效果，筛选出最佳骨修复材料并确定最佳药物控释方式。以淫羊藿苷为诱导因子，采用两相混合冷冻干燥技术以微球载药、改性药物微球(W/O法制得并表征)、改性药物与材料共价结合等药物添加方式及不加药制得4种支架材料，并对其进行显微结构以及载药支架药物缓释表征，后将4种材料分别植入兔桡骨缺损处，于1、3、6个月进行X射线及三维CT观察支架材料对兔桡骨缺损的修复情况，HE，Masson染色观察其诱导成骨效果。结果表明，支架材料呈网络状串珠状的显微结构，载药微球粒径分布在3～11 μm，载药支架材料有着良好的药物缓释，其中共价结合组药物释放峰值时间较其他组推迟，为72 h，且峰值后药物缓释量迅速平稳为75 μg左右。X射线及三维CT观察显示，最终共价结合组支架材料骨缺损处连通，且骨密度高于其他3组。HE、Masson染色结果显示，共价结合组成骨效果优于其他组。共价结合的药物添加方式能使支架具有良好的药物缓释效果，进而对兔桡骨缺损表现出良好的修复效果。

聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯；诱导；共价结合；骨修复

引言

骨损伤是临床常见病，目前常采用自体骨、异体骨或组织工程骨移植等方法治疗[1]。自体骨移植是骨缺损修复治疗的金标准，但来源有限且给供骨区造成新伤，异体骨移植因免疫排异反应失败风险大[2]，组织工程骨有较高的生物安全性，来源广泛，因而对于骨缺损修复有着良好的前景[3]。

支架材料力学性能与宿主骨接近，既可对骨缺损部位起到一定的支撑作用，又能够促进骨缺损的修复[4]。目前大部分骨组织工程材料力学性能均未能与骨本身匹配，天然高分子材料力学性能较差，合成高分子材料力学性能稍好，但降解性能较差，因此，将二者进行复合制备力学强度和生物降解性兼具的生物支架材料，在临床应用中具有一定的潜力。复合生物材料最接近人体骨的网状结构、生物力学性能，有类似自然组织的构型和功能[5]。第三代骨组织工程支架材料提出支架材料中添加诱导因子以促进缺损处骨修复，目前诱导因子主要以各种骨相关生长因子为主[6]，淫羊藿苷(icariin，Ica)是非常有效的生骨中药，性质稳定，以某种形式添加至支架材料使之缓释，能够长效诱导骨缺损处新骨形成[7]。

本实验以合成高分子材料PHBV和天然高分子材料壳聚糖为基础材料制备了4种复合支架材料，一种作为空白对照，另外3种以不同形式添加以Ica。通过4种支架对青紫蓝兔桡骨缺损进行修复，评价比较3种药物添加方式所制支架材料各自在实验兔体内对桡骨骨缺损的修复效果，旨在从中筛选出1种骨修复效果最佳的支架材料及1种最佳的药物添加方式，为将来临床应用提供动物实验参考。

1 材料和方法

1.1 材料

实验动物：4月龄清洁级青紫蓝兔36只，雌雄不限，体重2.0～3.0 kg(兰州生物制品研究所提供，许可证号：(甘)SYXK2007-002)。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。

淫羊藿苷(中国食品药品检定研究院)、羧甲基壳聚糖(粘均分子量9 000，南京森贝伽生物科技有限公司)、 壳聚糖(脱乙酰度≥85%，粘均分子量约300 000，济南海得贝海洋生物工程有限公司)、六氟异丙醇(Sigma，美国)、PHBV(粘均分子量约360 000，宁波天安生物材料有限公司)、EDC(阿拉丁公司)、NHS(阿拉丁公司)。Masson染色试剂盒(北京博奥拓达科技有限公司)。

动物手术用聚光灯(江阴光电仪器有限公司)、ZT-12M2生物组织自动脱水机(湖北亚光医用电子技术有限公司)、TB-718E生物组织自动包埋机(湖北泰维医疗科技有限公司)、Rotary Microtome 820组织切片机(美国AO)、X线照射拍片系统(兰州军区总医院放射科提供)、640层螺旋CT(兰州军区总医院影像诊断科提供)。

1.2 方法

1.2.1 壳聚糖载药微球的制备

壳聚糖作为缓释材料，W/O法制备载药微球：室温下取200 mL液体石蜡于500 mL锥形瓶中，加1 mL的Span-80磁力搅拌混合均匀，制成油相；取40 mg Ica或Ica-NH2加入提前配好的40 mL 0.75%(W/V)的壳聚糖醋酸溶液中，充分混合溶解(醋酸浓度为1 %(V/V))制成水相。将水相缓慢(30 s/滴)滴入油相中，磁力搅拌乳化分散待微球全部固化，离心，石油醚洗涤2次，无水乙醇洗涤4次，冷冻干燥，即获得Ica或Ica-NH2的壳聚糖微球(Ica-CSM或Ica-NH2-CSM)。

1.2.2 羧甲基壳聚糖与淫羊藿苷共价结合

首先用二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl pyrocarbonate，BOC)把氨基乙酸(glycine，GLY)中的氨基保护起来[8]，然后将Ica和被保护了氨基的GLY用二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide，DCC)/4-二甲氨基吡啶(4-dimethylamino pyridine，DMAP)缩合成酯[9]，脱掉BOC即得到氨基化产物[10]，最后利用EDC/NHS法把Ica-NH2中的氨基与材料中的羧甲基壳聚糖上的羧基通过缩合反应连接起来[11]。

1.2.3 微球的扫描电镜图

取Ica-CSM、Ica-NH2-CSM各少量，将微球样品均匀撒在粘有导电胶的硅片上，喷金，扫描电子显微镜(SEM)观察微球的表面形貌。

1.2.4 支架材料的构建

本实验共制备了4种支架材料，分别是空白对照组(PHBV 和CS)、Ica-CSM 组(PHBV、CS和Ica- CSM)、Ica-NH2-CSM组(PHBV、CS和Ica-NH2-CSM)和Ica-NH2共价组(PHBV、CS和氨基化淫羊藿苷羧甲基壳聚糖共价结合物)。

1.2.4.1 空白材料对照组支架材料的制备

将100 mL 20 %(W/V)的聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯(polyhydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate，PHBV)溶液(溶剂为二氯甲烷)倒入50 mL 5%(W/V)的CS醋酸溶液中，匀浆机11 000 r/min高速搅拌均匀后，静置沉积脱泡，挤压注入环形不锈钢模具中(内径4 mm，外径6 mm；长13 mm)成型，连同模具一同置于液氮中冷冻10 min，迅速取出，置4℃水中5～10 s后，脱模，冷冻干燥成型，得到直径3.4～3.5 mm，长(12±1) mm的淡色圆柱状支架材料。

1.2.4.2 Ica-CSM组支架材料的制备

将100 mL 20 %(W/V)的PHBV溶液(溶剂为二氯甲烷)倒入到50 mL 5 %(W/V)的混合有一定量Ica-CSM的5%(W/V)的CS醋酸溶液中(后续步骤与本文第2.4.1节相同)，所得支架材料外观与本文第2.4.1节中空白材料对照组支架材料相同。

将 100 mL 20%(W/V)的 PHBV 溶液(溶剂为二氯甲烷)倒入到 50 mL 5%(W/V)的混合有一定量Ica-NH2-CSM的5 %(W/V)的CS醋酸溶液中(后续步骤与本文第2.4.1节相同)，所得支架材料外观与本文第2.4.1节中空白材料对照组支架材料相同。

1.2.4.4 Ica-NH2共价键结合组支架材料的制备

将100 mL 20 %(W/V)的PHBV溶液(溶剂为二氯甲烷)倒入到50 mL 5%(W/V)的混合有Ica-NH2共价结合的羧甲基壳聚糖的5%(W/V)的CS醋酸溶液中(后续步骤与本文第2.4.1节相同)，所得支架材料外观与本文第2.4.1节中空白材料对照组支架材料相同。

1.2.5 支架材料显微结构表征

骨修复材料断面经喷金后，扫描电子显微镜观察材料的断面形态。

1.2.6 3种载药支架材料的药物缓释

3种载药支架材料各取3块，置于10 mL、0.01 M的PBS中，37℃，分别于1、2、4、8、12、24 h取缓释液样品，随后隔24 h取样直到336 h，每次取样1 mL保存待测，并回补1 mL、0.01 M的PBS，全部取样完毕，利用紫外分光光度计于270 nm处检测不同时间点的吸光度，计算缓释量并绘制药物缓释曲线。

固若金汤！那个狗日的胖子煤老板整日嘴上喋喋不休着说西山固若金汤！去他妈的固若金汤吧！西山成了我们这些窑黑子兄弟集体的坟墓了，你却用什么“固若金汤”来灌我们。你狗日的愚弄了我们啊！我要杀了你!不，我要掐死你！我要用牙齿咬断你的喉管，让它向外汩汩地冒血！我想你的血也一定是黑的，和西山的煤面儿一样黑。

1.2.7 复制兔桡骨骨缺损模型

清洁级青紫蓝兔36只，雌雄不拘，体重2.0～3.0 kg，随机分为A、B、C、D等4组，每组9只。术前24 h禁食禁水。

手术流程：称体重，3%(W/V)戊巴比妥钠通过耳缘静脉注射进行麻醉，剂量为1.0 mL/kg，采取俯卧位将实验兔固定在手术台上，实施手术的区域去毛备皮，碘伏涂抹消毒，铺无菌洞巾，于兔左前臂平行于桡骨的方向从中间位置将皮割开，后小心分离肌肉、筋膜，直至桡骨手术段充分暴露，骨剪剪除桡骨1.2 cm骨段，并彻底刮除该段骨膜。

1.2.8 实验分组及手术

A组为空白对照组，B组为Ica-NH2共价组，C组为Ica-NH2-CSM组，D组为Ica-CSM组。用支架材料修复骨缺损模型，植入的支架材料两端跟桡骨两断端对齐，用医用缝合线固定于腓骨上，逐层缝合伤口，涂抹碘伏，无菌纱布、绷带包扎固定伤口。

1.2.9 术后处理

4组实验动物术后持续观察伤口情况，碘伏涂抹伤口。术后麻醉期间置保温灯下保温，待实验兔苏醒后分别将其置于饲养笼内，连续3天青霉素肌肉注射，每只每天注射4万单位，以预防伤口感染。分别于术后1、3、6个月取实验兔空气栓塞法处死，取骨缺损修复处及周边组织，10%福尔马林固定后待处理。

1.2.10 动物术后及大体标本观察

术后3天内观察实验兔饮食、运动、伤口恢复等情况，并记录；分别于术后1、3、6个月空气栓塞法处死，完全暴露骨缺损修复段，大体观察骨缺损修复情况，拍照记录。

1.2.11 X射线检测

各组分别于术后1、3、6个月每组取3只实验兔共12只，对骨缺损区行X射线检查，垂直投照，距离40 cm，剂量1 500 mA，曝光时间2 s。

1.2.12 三维CT观察

每组取3只实验兔麻醉后固定于CT床上，扫描其左前臂骨缺损修复处。

1.2.13 组织学观察

分别于术后1、3和6个月处死实验兔，分离并完整取下桡腓骨骨段，10%的福尔马林常温下固定72 h后，于5 %的EDTA脱钙液中进行常规脱钙，每周更换一次EDTA，脱钙完毕后取材，分别取桡骨腓骨横截面及纵截面；自动脱水机脱水，石蜡包埋机包埋，切片机连续切片，厚度为5 μm，行HE及Masson等组织学染色，光学显微镜下观察、拍照。

2 结果

2.1 SEM观察微球及粒径分布测定

图1为壳聚糖微球SEM照片以及粒径分析，可以看出，两种微球均具有较好的成球性，表面光滑。Ica-CSM粒径主要集中在3～11 μm范围内，以4～7 μm小球居多(见图1(a))，而Ica-NH2-CSM微球粒径主要集中在3～8 μm范围内，以3～5 μm小球居多，均匀性更好见(图1(b))。

图1(c)～(d)为动静态多角度激光光散仪测定的3种微球的微球粒径分布。可见，两种微球的粒径主要集中在3～12、3～9 μm范围内。

图1 微球SEM观察与粒径分析。(a)Ica-CSM的扫描电镜观察；(b) Ica-NH2-CSM的扫描电镜观察；(c)Ica-CSM的粒径分析(d)Ica-NH2-CSM的粒径分析Fig.1 SEM observation of the microsphere and its particle size analysis.(a) SEM scaning of Ica-CSM；(b)SEM scaning of Ica-NH2-CSM；(c)Particle size of Ica-CSM；(d)Particle size of Ica-NH2-CSM

2.2 支架材料及其显微结构

图2为支架材料及其微观结构，支架材料为直径3.4～3.5 mm、长(12±1)mm的淡色固体棒状物(见图2(a))，横截面显示中间留孔(见图2(b))，显微结构呈网络状串珠状的分布，PHBV 呈链接球状(链球直径约1 μm)，均匀分布在CS聚合物的网络之间，整个断面均匀分布着0.3～1.0 μm的微孔(见图2(c))。

图2 支架材料外观及其显微结构(a)支架材料的外观；(b)支架材料横截面形貌；(c)支架材料的显微结构Fig.2 The scaffold and its microstructure (a) Appearance of the scaffold; (b) Cross section of scaffold topography; (c) Microstructure of the scaffold

2.3 3 种载药支架材料的药物缓释

图3为3种载药支架材料的药物缓释曲线，显示，Ica-CSM组支架材料(见图3(c))和Ica-NH2-CSM组支架材料(见图3(b))的药物释放在48 h达到最大，均达到了225 μg 左右，48 h后，药物缓释缓慢减少，药物释放逐渐趋于平缓；而Ica-NH2共价组(见图3(a))的药物释放在72 h达到最大，最大释放量达到250 μg，72 h后药物释放并较快速地减小，随后药物释放趋于平缓。

图3 3种载药支架材料的药物缓释。(a)Ica-NH2共价组；(b)Ica-NH2-CSM组；(c)Ica-CSM组Fig.3 The drug release of the three drug loaded scaffolds. (a) Ica-NH2 Covalent binding group; (b) Ica-NH2-CSM group; (c) Ica-CSM group

2.4 大体观察结果

图4为兔桡骨骨缺损模型，植入支架材料(见图5)。术后实验兔20 min左右苏醒，当日即有饮食，活动量减少，周内伤口无感染溃脓及红、肿、热、痛等现象，固定纱布自行脱落，术后两周活动量恢复，走动未见瘸跛。

图4 兔桡骨缺损模型Fig.4 The model of radius segmental defect of rabbits

图5 支架材料植入兔桡骨缺损处Fig. 5 Scaffold materials implanted in the defect of rabbits radius segmental

图6为1、3、6个月时取材作为标本观察支架材料的大体状况，发现术后1个月周围组织将支架材料完全包裹，支架材料棱角明显；术后3个月支架材料与骨缺损截骨断端相连；术后6个月支架材料被新生组织严密包裹，支架材料棱角消失，仔细观察可见支架材料与骨缺损截骨断端界线模糊，支架材料与截骨断端有较好的结合。

图6 不同时间段骨修复取材观察。(a)1个月；(b)3个月；(c)6个月Fig. 6 Observation of bone repair for different times. (a) 1 month; (b) 3 months; (c) 6 months

2.5 兔桡骨缺损修复的影像学观察

2.5.1 X射线观察

图7为兔左前腿X片。术后1个月：4组骨缺损修复处，Ica-NH2共价组在整个缺损区有不均匀影像显示，密度低于正常骨密度，其他3组断端处有模糊影像，密度较低。术后3个月：空白对照组缺损处有不规则影像显示，密度较小且不均匀；Ica-NH2共价组缺损处显示有较大面积均匀影像；Ica-NH2-CSM组在靠近尺骨的部位有部分影像；Ica-CSM组左截骨端处有模糊影像，密度较低。术后6个月：空白对照组缺损段中段不规则影像贯通缺损段，左边部分有明显缺口且整体影像密度不均匀；而Ica-NH2共价组缺损处可见均匀影像充满缺损处，该处影像显示仍呈凹陷状，凹陷处边缘影像显示密度较高；Ica-NH2-CSM组和Ica-CSM组与3个月比较，影像密度差异不明显。

图7 4组支架材料分别在1(左)、3(中)和6(右)个月时骨修复效果X射线影像学观察。(a)对照；(b)Ica-CSM；(c)Ica-NH2-CSM；(d)Ica-NH2Fig. 7 X - ray observation of bone repair effect for four groups of scaffold material at different periods (From left to right: 1,3,6 months). (a) Control; (b) Ica-CSM; (c) Ica-NH2-CSM; (d)Ica-NH2

2.5.2 三维CT重建图片结果观察

图8为兔左前腿三维CT重建图像。术后1个月：空白对照组显示材料周围有新骨形成，骨桥未连接；Ica-NH2共价组靠近尺骨侧缺损处有骨桥建立，缺损处左右两断端均有突起的新生骨形成；Ica-NH2-CSM组与其他两组一样，断端比较圆润，新骨生成不明显；Ica-CSM组修复情况与Ica-NH2-CSM组比较，效果相同。术后3个月：空白材料组缺损处缺口变小，新生骨逐渐将材料接近尺骨一侧包裹；Ica-NH2共价组断端突起显著，并同时向中间伸长，材料靠近尺骨一侧逐渐被新生骨组织包裹；Ica-NH2-CSM组和Ica-CSM组缺损修复不甚明显，有一定的新生骨形成，但新骨形成较少。术后6个月：空白对照组缺损两端部分已连接，支架材料被新生骨包裹；Ica-NH2共价组缺损两断端部分连接，两端突起部分连续向中间伸长，修复效果与3个月比较有明显增强；Ica-NH2-CSM组和Ica-CSM组骨缺损修复效果较3个月时有所改善，与Ica-NH2共价组比效果较差。

2.6 兔桡骨修复的组织学观察

2.6.1 HE染色观察

图9为HE染色结果显示，材料与组织边界没有炎症瘢痕组织，说明支架材料与组织无明显排斥反应。

术后1个月:4种支架材料周围均有大量新生细胞，空白对照组支架材料周边有新生骨小梁形成，界面有纤维组织；Ica-NH2共价组支架材料周边有大量新生骨组织；Ica-NH2-CSM组支架材料周边有岛状类骨质形成，新生骨量较少，成骨化水平低于Ica-NH2共价组；Ica-CSM组支架材料与新生组织紧密结合，支架材料周围新生组织显示为骨组织。术后3个月:空白对照组周围仍有大量纤维组织，支架材料外层新生骨量较少；Ica-NH2共价组纤维组织减少，新生骨量较多，材料显示部分降解，新生骨呈板层状骨样结构，组织跟材料骨性结合；Ica-NH2-CSM组新生骨呈板层状骨样结构，结构松散；Ica-CSM组仍存在岛状类骨质，且结构松散。术后6个月:空白对照组材料界面以纤维组织为主，且新生骨呈现岛状类骨质；Ica-NH2共价组纤维层基本消失，新生骨呈板层状骨样结构；Ica-NH2-CSM组纤维层消失，新生骨呈板层状骨样结构；Ica-CSM组组织与支架材料界面仍有纤维组织。

图8 4组支架材料在不同时段骨修复效果的三维CT影像学观察(从左至右分别为1、3、6月)。(a)对照；(b)Ica-CSM；(c)Ica-NH2-CSM；(d)Ica-NH2Fig.8 Three-Dimensional CT observation of bone repair effect for four groups of scaffold material at different periods (From left to right: 1,3,6 months). (a)Control; (b)Ica-CSM; (c)Ica-NH2-CSM; (d)Ica-NH2

图9 不同时间点的HE染色观察(100×)(从左至右分别为1、3、6个月；蓝色箭头指向材料，黑色箭头指向新生骨组织)。(a)对照；(b)Ica-CSM；(c)Ica-NH2-CSM；(d)Ica-NH2Fig. 9 HE stained sections of four groups at different periods(100×) (From left to right: 1,3,6 months; The blue arrow points to the material, the black arrow points to the new bone tissue).(a)Control; (b)Ica-CSM; (c)Ica-NH2-CSM; (d)Ica-NH2

图10 各组分别在1(左)、3(中)和6(右)个月Masson染色观察(100×)(蓝色箭头指向材料，红色箭头指向新生骨组织，黄色箭头指向纤维组织)。(a)对照；(b)Ica-CSM；(c)Ica-NH2-CSM；(d)Ica-NH2Fig.10 Masson stained sections of four groups at 1(left),3(middle) and 6(right) months (100x) (the blue arrow points to the material, the red arrow points to the new bone tissue, the yellow arrow points to fibrous tissue). (a)Control; (b)Ica-CSM; (c)Ica-NH2-CSM; (d)Ica-NH2

HE染色结果表明，Ica-NH2共价组能有效诱导骨形成，有利于支架材料与组织的骨性融合。

2.6.2 Masson染色观察

图10为Masson染色结果。术后1个月：空白对照组支架材料和新生骨之间被纤维组织隔开，出现新生骨小梁结构；Ica-NH2共价组材料周围纤维组织较少，新生骨量较多；Ica-NH2-CSM组，Ica-CSM组支架材料与新生骨组织界面有大量纤维组织，新生骨量较少。术后3个月：空白对照组新生骨面积增大；Ica-NH2共价组新生骨数量增加且面积增大；Ica-NH2-CSM组以大量纤维组织为主，新生骨面积与1个月比较增大了；Ica-CSM组主要以纤维组织为主。术后6个月：空白对照组材料与组织界面仍以大量纤维组织为主；Ica-NH2共价组新生骨组织与支架材料紧密结合，纤维组织消失，以新生骨为主；Ica-NH2-CSM组新生骨组织数量明显增多，但其周围仍以纤维组织为主，新生骨与支架材料未能有良好的骨性结合。Ica-CSM组新生骨组织与材料界面仍被纤维组织隔开，且纤维组织较多。

以上结果提示，Ica-NH2共价组具有良好的骨修复效果。

3 讨论

PHBV 是一种具有良好的生物可降解性和组织相容性的材料[12]。Miao等发现，共混的方法能够降低PHBV的结晶速率，增加PHBV的韧性[13]。将成骨细胞接种到PHBV支架在体外培养，细胞在支架上增殖良好并能分泌碱性磷酸酶和骨钙素[14]。

壳聚糖有一定的抑菌作用，可塑性强，但力学强度不够，常用于支架材料作为细胞生长因子的载体[15]，壳聚糖在液态介质中可与带负电荷的聚合物、大分子甚至一些聚阴离子如透明质酸、明胶等相互作用，形成稳定的聚电解质复合物，促进细胞有丝分裂，诱导合成生长因子并延长其半衰期[16-17]。

PHBV与壳聚糖共混制备复合支架材料，既能增加材料的强度与韧性又能克服PHBV的脆性和疏水性，还有利于细胞，附和增殖，可作为一种良好的骨组织工程支架材料。

两相混合急速冷冻/冷冻干燥成型形成网络状串珠状的微结构有利于细胞的黏附与增殖[18-19]。本研究所制备复合支架材料均匀分布着3～10 μm的微孔及串珠，能够有效促进细胞的黏附与增殖。

诱导因子是骨组织工程研究非常重要的一个因素，组织工程中诱导因子持续的作用能够显著增强其组织诱导作用，微球控释诱导因子是一种使诱导因子能够持续释放的控释方式[20]。将诱导因子与可降解三维支架材料以某种方式结合，也是一种有效的诱导因子控释方式。可以通过诱导因子与支架材料间的作用实现，比如包埋、静电吸附、氢键结合及表位亲和等[21-22]。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，具有促进成骨细胞成骨、加速成骨细胞碱性磷酸酶分泌、促进骨骼钙化和骨形成等作用[23-24]。本研究以微球包载诱导因子Ica以及Ica-NH2与支架材料共价结合等方式作为组织工程支架材料的诱导因子控释方式，通过比较支架材料对兔桡骨缺损的修复效果来得出较佳的诱导因子添加方式。

4 结论

通过3种载药支架的药物缓释实验结果分析，发现Ica-NH2共价组支架材料药物突释时间最短，药物释放量比其他两组高，且其药物释放最先进入稳定期，而且最接近淫羊藿苷的最佳作用浓度，这样的药物缓释最有利于其发挥诱导作用。

大体观察可见1、3、6个月时支架材料被新生组织包裹，支架材料棱角随时间变模糊，与组织结合越来越紧密；支架材料较致密，生物降解性较差，未能与骨组织发生骨性结合。

X片结果结合CT结果显示，Ica-NH2共价组新骨形成量高于其他3组，可能是由于支架材料对断端骨组织的促进增殖及诱导作用，使得新生骨组织沿着材料生长，故三维CT重建图上显示有新骨突起的形成，而X片上显示有密度小于正常骨的新生骨填充兔桡骨缺损处。Ica-NH2共价组支架材料，药物以共价的方式与支架结合，这种药物结合的方式使得有部分药物裸露在支架材料表面，支架材料植入骨缺损处药物与组织即发生接触，从而对组织产生促进增殖及诱导的作用，且药物浓度能够长时间维持在一个稳定的水平，故其诱导能力表现优于其他组。HE和Masson染色结果同样显示支架材料周围有大量新骨形成，且Ica-NH2共价组支架材料成骨效果最佳。

综上所述，本研究证实Ica-NH2共价组支架材料是一种具有良好骨诱导性的支架材料，利用药物与支架材料共价键结合实现药物控释，是一种良好有效的优于微球包载药物的药物释控方式。

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An Inducible Bone Repair Composite Material PHBV/CS: The Renovation of Rabbit Radius

Li Gen Zhen Ping Cheng Manping Zhao Hongbin*

(LanzhouGeneralHospitalofLanzhouCommand,Lanzhou730050,China)

In this work, four kinds of chitosan/poly hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate(PHBV)composite scaffold were fabricated by the method of two phase mixture freeze drying.The repair effects of the scaffoldswere investigated and compared to determine the optimal formula for guiding bone regeneration as well as drug releasing. The icariin (Ica) was used in this study as an osteoinductive factor, and Ica microspheres were fabricated by W/O method and covalent binding. Microstructures of the scaffolds and drug releasing behaviors were investigated.After that,the scaffolds were implanted in the radius defects of rabbits;X-ray and 3D CT were applied to observe the repair effect at 1, 3, and 6 months post surgery. The osteogenesis inducible effects were evaluated using HE and Masson staining. The scaffolds showed network-like microstructures with particles inside, the drug loaded particles was 3-11 μm in diameter. The scaffolds released Ica well, though the peak of drug release curve for the covalent binding group was delayed than the others. The peak appeared at 72 h after immersion and quickly reached a stabled level of 75 μg. The images of X-ray and 3-D CT showed the defect of the rabbit radius had connected and the bone mineral density was higher than the other three groups. HE and Masson stained sections of the radius segmental defect of rabbits implanted for 1, 3, and 6 months showed that the scaffold with covalently binding Ica had better repair effect than the others.

poly hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate (PHBV); inducible; covalent binding; bone repair

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 06.012

2015-12-03， 录用日期:2016-08-30

甘肃省科技重大专项(1203FKDA036)

R318.08

A

0258-8021(2016) 06-0719-10

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: zhao761032@163.com