水下冲击波致兔脊髓损伤的神经机能变化及其病理特点

姜永田 滕海军 张 栋 谢 东

(1 潍坊医学院研究生系研究生教研室，潍坊市 261000，E-mail：yongtian818@163.com；2 中国人民解放军第89医院脊柱外科，潍坊市 261021；3 山东省淄博市临淄区人民医院脊柱外科，淄博市 255400)

论著·基础研究

水下冲击波致兔脊髓损伤的神经机能变化及其病理特点

姜永田1滕海军2张 栋3谢 东1

(1 潍坊医学院研究生系研究生教研室，潍坊市 261000，E-mail：yongtian818@163.com；2 中国人民解放军第89医院脊柱外科，潍坊市 261021；3 山东省淄博市临淄区人民医院脊柱外科，淄博市 255400)

目的 探讨水下冲击波致兔脊髓损伤的神经机能变化及其病理特点。方法 选取48只新西兰大白兔随机分为A、B、C、D组各12只，通过手术将大白兔脊髓暴露后将其固定于封水仓内，仅椎板切除段脊髓外露于冲击波作用之下，用铵松蜡炸药2 g为水下爆源，其中A、B、C组分别按冲击波到达脊髓表面的超压峰值2.6 MPa、2.8 MPa、3.0 MPa致伤，检测冲击波的超压峰值及作用时间。D组不致伤，作为对照组。通过BBB法运动学评分、体感诱发电位检测、脊髓组织苏木精-伊红(HE)染色及透射电镜观察，评估各组水下冲击波致脊髓损伤后的神经机能变化及病理特点。结果 水下冲击波致伤后，实验组动物均瘫痪，D组没有瘫痪。致伤12 h及24 h后A组、B组、C组的BBB评分依次减低(P<0.05)，且均低于D组(P<0.05)；致伤24 h后A、B、C各组大白兔BBB评分低于致伤12 h后(P<0.05)。致伤12 h及24 h后A组、B组、C组的体感诱发电位潜伏期依次延长(P<0.05)，且均高于D组(P<0.05)；波幅依次下降(P<0.05)，且均低于D组(P<0.05)。与致伤12 h后比较，A组、B组、C组致伤24 h后的潜伏期均延长(P<0.05)，A组及B组波幅均下降(P<0.05)。致伤48 h时组织形态学和电镜下示A组、B组、C组脊髓出血坏死，结构破坏，髓鞘板层分层，轴索变形水肿，A组、B组、C组动物脊髓HE染色阳性率依次降低(P<0.05)，且均低于D组(P<0.05)。结论 水下冲击波可造成水下动物脊髓损伤，其致伤程度与动物接受的爆炸冲量有关，且在一定时间内存在继发性损伤。

脊髓损伤；水下冲击波；神经机能；病理；兔

水下冲击伤是现代战争中的一种常见伤，尤其在岛屿作战和登陆作战中常见，以往战争中水下冲击伤发生率较高[1]，其死亡率高[2]。20世纪60～70年代国外曾对水下冲击伤的防护进行了大量研究；国内对水下冲击伤也做了一系列研究，在冲击损伤机制、生物力学响应、人体耐受性及防护研究等取得了一定成果[3]。随着对水下冲击伤研究的深入，国内外学者发现水下冲击波不仅对空腔脏器可造成损伤，对实质脏器(如中枢神经系统)也可造成伤害[4]。本实验旨在探索水下冲击波对脊髓造成损伤的特点。

1 材料与方法

1.1 实验动物 由鲁抗实验动物繁育中心提供的成年新西兰大白兔48只(许可证号：41880120)，雌雄不限，体重2.1～2.6 kg，3～4个月龄。饲料配方为10%猪油、37%蔗糖混合53%基础饲料，由江苏双狮实验动物饲料有限公司配制，上、下午各喂养1次。采用随机区组法将大白兔分为分为 A、B、C、D组各12只，将大白兔固定于封水仓内，仅椎板切除段脊髓外露于冲击波作用之下，A、B、C组(实验组)分别按照冲击波到达脊髓表面的不同超压峰值(2.6 MPa、2.8 MPa、3.0 MPa)致伤，D组不致伤，作为对照组。术前所有大白兔均采用Basso Beattie Bresnahan(BBB)法[5]行运动学评分，均完全正常。术前各组均行体感诱发电位检测，4组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 术前各组动物体感诱发电位潜伏期和波幅(x±s)

1.2 主要试剂及仪器 3%戊巴比妥钠注射液(美国Sigma公司，批号：F20140205)，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色试剂盒(上海化学总公司试剂分部，批号：150723)，生物显微镜(日本奥林巴斯公司，型号CX21)，肌电图诱发电位仪 (丹麦丹迪公司，型号NDI-092)，水下压力自动测试仪 (杭州美控自动技术有限公司，型号R2008S)，铵松蜡炸药2 g(龙海爆破研究所，批号140603)，实验水槽(中国人民解放军第89医院中心实验室，型号QT0357D)。

1.3 方法

1.3.1 水下冲击波参数测定：水下爆炸源采用铵松蜡炸药2 g，水下0.3 m实验水槽中心位置安置爆炸源。固定爆炸源，调整传感器与其的距离，记录产生超压峰值为2.6 Mpa、2.8 Mpa、3.0 Mpa时的爆炸源与传感器的距离，实验时将相应分组的大白兔放置在此，并应用杭州美控自动技术有限公司研发的R2008S冲击波测试分析系统分别检测距离爆炸源不同距离的冲击波超压峰值和持续时间。

1.3.2 脊髓冲击伤模型的建立：用浓度为3%戊巴比妥钠注射液(25 mg/kg)经耳缘静脉对大白兔进行麻醉，备皮，将四肢及头部俯卧位固定于特制的固定架上。以T9为中心取背部正中皮肤切口，长约6 cm，暴露 T8～T10。咬除椎板，充分显露硬脊膜。调制水温为30℃左右，将A、B、C 3组实验动物分别放置于水下1 m的实验水槽中，制作通气道保证呼吸正常进行，选用质地结实的橡胶覆盖实验动物背部，对重要脏器给予保护，橡胶板开一直径为5 cm圆孔，显露脊柱脊髓实验区域，将特制铵松蜡炸药2 g分别安置于距爆炸源不同距离处，调节脊髓节段垂直于爆炸冲击波传导的方向，调整好位置使之正好对准暴露的硬脊膜，检验动物模型是否稳定、牢固；电子发爆器水下引爆。按 A、B、C组分别以2.6 Mpa、2.8 Mpa、3.0 Mpa超压峰值压力，给T8～T10节段实施单次冲击。D组动物暴露脊髓后放于水中，不作水下冲击波冲击。动物纳入实验组的标准为：(1)动物存活；(2)大白兔双后肢不同程度的抽搐、尾巴摇摆；(3)家兔背部仅伤及皮肤，皮下组织无穿透伤。大白兔致伤后，每日肌注青霉素3万U/次，每2次/d、按摩膀胱协助排尿，各组分笼饲养，喂养同术前，各组无区别。

1.3.3 运动学评分：分别于冲击波冲击前、冲击后12 h和24 h，采用双盲法根据BBB评分法分别对各组大白兔进行评分，每只兔子至少观察5 min。本实验中BBB评分≥16分记为正常，BBB评分<16分记为瘫痪[6]。

1.3.4 体感诱发电位：分别于冲击波冲击前、冲击后12 h和24 h，将所有大白兔麻醉后固定于固定架上，将针式电极作为记录电极，置于两耳连线与矢状缝交点，大白兔鼻根部接参考电极，前肢贴地。在单侧后肢跟腱内上方放置叉状刺激电极，采用波宽为0.2 ms的脉冲电流以3 Hz的频率刺激兔单侧胫后神经，以刺激兔趾轻微抽搐为准，电流3～4 mA，分析时间为 15 ms，平均行80～100次检测。

1.3.5 组织形态学检查：于冲击波冲击后48 h将所有大白兔麻醉，然后用4%多聚甲醛-磷酸缓冲固定液经左心室行心脏灌注固定，解剖椎管，取2 cm T9～T10节段脊髓，放入4﹪多聚甲醛液中2周后，脱水，石蜡包埋，每隔6张取1张，行横断面切片，常规HE染色。各组12只大白兔全部纳入计数，每只计数5张，400倍光镜下，每张切片随机选取损伤部位中心左侧和右侧视野各一，由不了解实验进程及分组情况的人员观察脊髓组织神经元的形态变化，并手工计数，取每张切片两侧视野正常神经元的数量之和的平均值，即为每个标本存活神经元数量的平均值。

1.3.6 透射电镜下观察：于冲击波冲击后48 h将2 cm T9～T10节段脊髓先在2.5%戊二醛中固定6 h，用pH 7.4的磷酸缓冲液充分清洗后，再用1%锇酸固定，脱水、包埋，行超薄切片，每张厚50～60 mm，透射电镜下观察各组脊髓神经元的超微结构变化，透射电镜下观察结构有无破坏，髓鞘板层有无分层，轴索有无变形水肿，并拍照。

1.4 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以(x±s)表示，两组均数比较方差齐时采用t检验，方差不齐则采用t′检验，多组均数比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组水下冲击波物理参数 随着距离爆心距离越远，水下冲击波超压峰值越大(P<0.05)，但各组持续时间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3个实验组水下冲击波物理参数(x±s)

注：与C组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05。

2.2 肢体运动学评分 水下冲击波致伤后12 h及24 h，实验组动物均为瘫痪，对照组D组没有瘫痪。冲击后12 h及24 h A组、B组、C组的BBB评分依次减低(P<0.05)，均低于D组。冲击后24 h实验组(A、B、C)各组大白兔的BBB评分较12 h降低(P<0.05)。见表3。

表3 致伤后12 h和24 h各组动物BBB评分(x±s，分)

注：与A组比较，#P<0.05； 与B组比较，*P<0.05；与C组比较，▲P<0.05。

2.3 致伤后12 h和24 h各组动物体感诱发电位潜伏期和波幅 体感诱发电位冲击后12 h及24 h A组、B组、C组的体感诱发电位潜伏期依次延长(P<0.05)，且均高于D组(P<0.05)，波幅依次下降(P<0.05)，且均小于D组(P<0.05)。与冲击后12 h比较，A组、B组、C组冲击后24 h的潜伏期均延长(P<0.05)，A组及B组波幅均减小(P<0.05)。见表4。

表4 致伤后12 h和24 h各组动物体感诱发电位潜伏期和波幅(x±s)

注：与A组比较，#P<0.05； 与B组比较，*P<0.05；与C组比较，▲P<0.05。

2.4 4组脊髓组织形态学改变及存活神经元数量 致伤后48 h，A组脊髓出现少量散在出血坏死灶，正常神经细胞比例减少不明显；B组可见较多散在出血坏死灶，以灰质为主；C组可见灰质大量神经细胞凋亡，白质神经细胞脱髓鞘化严重，正常神经细胞比例减少至(28.21±2.52)%；D组脊髓组织无明显改变，正常神经细胞比例为(96.23±1.09)%。A、B、C组动物脊髓HE染色阳性率依次降低(P<0.05)，且均低于D组(P<0.05)。见表5。

表5 致伤后48 h各组动物脊髓HE染色阳性率(x±s，%)

注：与A组比较，#P<0.05； 与B组比较，*P<0.05；与C组比较，▲P<0.05。

2.5 电镜下观察情况 A组髓鞘板层略有分层，近端轴管内密度不均，微管减少，轴索变形、变性，水肿。B组髓鞘板层分层，轴索变形，轴索内微管明显减少，部分髓鞘与轴索剥离、肿胀。C组髓鞘板层分层，水肿、出血，呈“洋葱样”改变，部分髓鞘与轴索剥离；水下冲击伤后髓鞘局灶性疏松，近侧轴索内线粒体肿胀、变性。D组正常。

3 讨 论

冲击伤是指冲击波共同作用于机体所产生的各种损伤，主要由超压和负压引起。冲击波在水下由于水底硬度和密度的不同，反射和吸收的量也会有所差异。空气密度约为水的1/800，且压缩性和稀散性远高于水，故水下冲击波相对空气冲击波具有传播速度快、传播距离远的特点，其致伤效应也与空气冲击波有所不同[7-8]。水下冲击波的传播速度是相同强度空气冲击波的3.2～4.1倍，相同质量三硝基甲苯水下爆炸是等距离地面爆炸压力值的227.1～247.2倍，冲量的8.2～11.2倍。当冲击波在水中传播至刚性障碍物，如礁石或水底时会发生反射，放大冲击波效应；当水下冲击波传至水与空气的交界面时，会反射而形成水中的拉伸波。水下冲击波物理参数的特征表现为峰值压力高，前沿上升时间仅数微妙，冲量大，但持续时间仅为数百微秒级。冲击伤的发生机制包括碎裂效应、内爆效应、惯性效应、压力差效应、血流动力学效应、负压与肺泡扩张效应、生物力学效应等[9]。水下冲击波对生物的杀伤效应显著强于空气冲击波，肺和腹腔脏器的损伤是早期救治的重要环节，损伤发生率高、死亡率高。

既往很多学者对水下冲击波对空腔脏器的损伤进行了大量研究，并且基本掌握了水下冲击波致空腔脏器损伤的规律[10-14]。在实践中，绝大多数水下冲击波会造成肺等空腔脏器损伤，致动物死亡。近年来发现水下冲击波对神经组织也会造成损伤[4]。本实验在保护动物其他脏器的前提下，观察了水下冲击波致脊髓损伤后的神经机能变化以及病理学特点。本研究结果显示，冲击后12 h及24 h A组、B组、C组的BBB评分依次减低(P<0.05)，提示随着水下冲击波超压峰值增高，大白兔瘫痪程度也加重。且在冲击后12 h及24 h，随着水下冲击波超压峰值增高，大白兔体感诱发电位的潜伏期逐渐延长、波幅逐渐减小(P<0.05)，表明脊髓损伤程度的逐渐加重。冲击后24 h A组、B组、C组的BBB评分和体感诱发电位的改变较12 h加重，提示水下脊髓冲击伤后存在继发性损伤，导致脊髓损伤逐渐加重。伤后48 h组织光镜结果显示，随着水下冲击波超压峰值增高，大白兔脊髓灰质神经细胞坏死、白质脱髓鞘化增多，坏死区逐渐增多，存活的正常神经细胞明显减少，神经细胞脱髓鞘加重。表明水下冲击波致脊髓损伤时，脊髓损伤程度与冲击波的当量呈正相关。这提示水下脊髓冲击伤患者应及早救治，防止受伤后由于继发性损伤导致脊髓神经元发生不可逆损伤，对脊髓的防护也尤为重要。

目前，由于实验条件和技术的不同，得到的数据差异性较大，以及动物与人体的实际差异性，动物实验中取得的定量数据不可推论到人体。在脊髓水下冲击伤中，脊髓凋亡细胞类别及其凋亡机制仍需进一步研究。脊髓水下冲击伤往往不是作为单一的损伤存在，水下冲击波造成的肺、胃、肝等空腔脏器的损伤对机体内环境的改变，是否参与脊髓的继发性损伤也需要进一步研究。

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Neuro-electrophysiological changes and pathological features of spinal cord injury caused by underwater shock waves in rabbits

JIANGYong-tian1,TENGHai-jun2,ZHANGDong3,XIEDong1

(1DepartmentofPostgraduate,SchoolofPostgraduate,WeifangMedicalCollege,Weifang261000,China; 2DepartmentofSpinalSurgery,the89thHospitaloftheChinesePeople′sLiberationArmy,Weifang261021,China; 3DepartmentofSpinalSurgery,LinziDistrictPeople′sHospitalofZiboCity,ShandongProvince,Zibo255400,China)

Objective To explore the neuro-electrophysiological changes and pathological features of spinal cord injury caused by underwater shock waves in rabbits.Methods Forty-eight New Zealand rabbits were randomly divided into Group A,Group B,Group C and Group D,with 12 rabbits in each group.After surgical exposure of spinal cord,the rabbits were fixed in the sealing water storehouse,and only the spinal cords with laminectomy were exposed to shock waves.Ammonium nitraterosin paraffin explosive with the dose of 2 g was taken as underwater blasting source.The rabbits of Group A,Group B and Group C were vulnerated by the overpressure peaks of 2.6 MPa,2.8 MPa,3.0 MPa from shock waves to spinal cord surfaces,respectively.The overpressure peak and actuation duration were measured.Group D was not vulnerated and was taken as control.The neuro-electrophysiological changes and pathological features of spinal cord injury in each group were evaluated using BBB Kinematics score,somatosensory evoked potential,hematoxylin-eosin(HE) staining of spinal cord tissues and transmission electron microscopy after spinal cord injury caused by underwater shock waves.Results After 12 hours of injury caused by underwater shock waves,paralysis was observed in all rabbits in the experimental groups,but not in Group D.After 12 and 24 hours of injury,the BBB scores decreased in the order of Group A,Group B and Group C(P<0.05),and the scores of these three groups were lower than the score of Group D(P<0.05).The BBB score after 24 hours of injury was lower than that after 12 hours of injury in Group A,Group B or Group C(P<0.05).After 12 and 24 hours of injury,the latent period of somatosensory evoked potential prolonged in the order of Group A,Group B and Group C(P<0.05),and the potential of these three groups were higher than that of Group D(P<0.05).And the amplitude of somatosensory evoked potential decreased in the order of Group A,Group B and Group C(P<0.05),and the amplitude of these three groups were lower than that of Group D(P<0.05).The latent period was longer in Group A,Group B or Group C,and the amplitude decreased after 24 hours of injury in Group A or Group B compare to those after 12 hours of injury(P<0.05).After 48 hours of injury,the results of histomorphology and electron microscopy showed that hemorrhage and necrosis structure damage,myelin layered plate layer,axonal deformation edema were observed in the spinal cords of Group A,Group B and Group C.The positive rate of HE staining of spinal cord tissues decreased in the order of Group A,Group B and Group C(P<0.05),and the rates of these three groups were lower than that of Group D(P<0.05).Conclusion Underwater shock wave can cause underwater spinal cord injury in animals,and the severity of injury is associated with the explosion impulse accepted,and the secondary injury exists during a certain period.

Spinal cord injury,Underwater shock waves,Nervous function,Pathology,Rabbit

姜永田(1989～)，男，在读硕士研究生，研究方向：脊柱外科。

滕海军(1970～)，男，博士，副主任医师，研究方向：脊柱外科，E-mail：tenghaijun89@163.com。

R 651.21

A

0253-4304(2016)04-0457-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.04.03

2015-11-30

2016-02-18)