血管内皮祖细胞增殖与迁移的研究进展*

马阳王红



血管内皮祖细胞增殖与迁移的研究进展*

马阳①②王红②

【摘要】血管内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，亦称为成血管细胞。随着近年来血管性疾病的增多，血管内皮祖细胞在动脉硬化性狭窄及闭塞性病变方面的作用越来越受到人们重视。但内皮祖细胞的增殖能力成为制约其运用的一大障碍。笔者通过大量阅读文献，就血管内皮祖细胞的增殖与迁移方面作一综述。

【关键词】血管内皮祖细胞； 增殖； 迁移

①昆明医科大学 云南 昆明 650500

②成都军区昆明总医院

First-author’s address：Kunming Medical University，the General Hospital of People’s Liberation Army in Kunming，Kunming 650500，China

血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一类能增殖、迁移并直接分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞。在血管性疾病多发的今天，血管内皮障碍作为始动环节贯穿整个动脉硬化、狭窄、损伤的过程。而试验中已经证实，EPCs的动员、增殖、归巢可提高缺血组织的血管新生，从骨动员后通过直接分化为成熟血管内皮细胞和归巢到损伤血管局部，通过旁分泌途径指导损伤的血管内皮修复，更换受损的内皮细胞［1］。但是EPCs的体外扩增十分困难，想要大规模运用于临床还有着其局限性，国内外对其研究也处于起步阶段。因此，本文就血管内皮祖细胞如何在体内外扩增的研究进展作一综述。

1　EPCs的概况

1.1EPCs的来源 自1997年Asahara等［2］首次将EPCs从成人外周血中分离出来，并证实其能表达内皮细胞标记物，分化成为成熟血管内皮细胞。有些文献［2-3］认为EPCs与造血干细胞同起源于胚外中胚层卵黄囊的血岛，由血液/血管母细胞发育而来。目前有研究证实，EPCs在成人体中主要分布于外周血、骨髓和脾等。机体在需要时能在血管内皮生长因子（VEGF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-csf）等细胞因子的作用下从骨髓增殖、迁移、归巢到血管受损部位参与修复活动。

1.2EPCs的特性与表面标记 血管内皮祖细胞作为内皮细胞的前体，两者的特性既有相似的地方又有所区别。EPCs既表达内皮系特异抗原vWF、CD31、CD34等，又表达特殊的CD133表面标记，同时EPCs具有高增殖和归巢特性。目前比较公认的血管内皮祖细胞表面标志物为CD34、CD133、VEGFR-2。

CD34是我们熟知的造血干细胞标记物之一，是白细胞分化抗原的一种，其广泛表达于内皮干细胞。早期试验中常用CD34+来富集EPCs，富集出的细胞能够分化为成熟内皮细胞，推测大多数为EPCs。但最近有研究证实CD34-细胞群中也有EPCs的存在［4］。使得此种富集细胞的方法受到挑战。

VEGFR-2（即人的KDR，鼠的Flk-1）也是EPCs高度富集的标志之一。作为从干细胞转换为成熟内皮细胞最早表达的分子标记，其配体对EPC有阳性趋化的作用。

CD133是近年来新发现的，具有5个跨膜结构域的糖基化多肽。它的分子质量为1 200 000，选择性表达于造血干/祖细胞。体外研究发现，CD133仅表达于血管内皮祖细胞，而在分化过程中其逐渐消失，不表达于成熟内皮细胞。因此，它为目前用于分离、富集EPCs最重要的分子标志。

在EPCs转化为成熟细胞的过程中，经过各种细胞因子诱导分化，能够吸收乙酰化低密度脂蛋白（acLDL）并与荆豆凝集素-1（UEA-1）结合，然后其表面标志CD133+的表达逐渐减弱至2周后完全消失而成熟内皮细胞表面标志如CD31+、E-钙粘附素、vWF等的表达增多［5］。而到底是哪些基因在调控此过程还属未知。

2　EPCs的分离

EPCs存在于外周血（如脐带血）、骨髓和脾中，故各研究多取这些组织做试验。在早期对EPCs的分离中多采用免疫磁珠法，原理即血管内皮祖细胞表面抗原与磁珠表面包被的抗体反应，再将其置于磁场之中，被结合的细胞就会在磁场力的作用下与其余细胞分群，如此就可以筛选出特定的细胞来。此种方法虽然能获得较纯的EPCs，但是数量过于稀少，不能满足科学研究的需要。近年来，试验多使用密度梯度离心法来筛选EPC。此种方法通过离心机的离心力达到沉降平衡，使细胞处于一种梯度的分布，然后可以直接收获位于界面层的单个核细胞，如此可大量筛选出试验用细胞。筛选出可用细胞后需要用倒置相差显微镜观察获得细胞形态并用流式细胞仪检测分子表面特征如CD34、CD14、CD31，尤其是CD133的阳性百分率来鉴定EPCs

3　EPCs的增殖和迁移

3.1TRPC-1 TRPC-1（Transient Receptor Potential Cannonical-1）是瞬时受体电位家族的一员，人体中的TRPC通道很类似于果蝇的TRP通道。TRPC-1也是被首先在果蝇身上发现，被认为是负责响应苍蝇的视觉［6］。结构上看，这一家族的成员之间很类似，都可以非选择性的透过阳离子，不同成员间Ca2+和Na+的选择性不同。TRPC-1主要定位于EPCs的质膜，已有研究试验发现，Ca2+含量的减少可触发SOCE（Store-operated Ca2+entry）的传感器STIM1，TRPC-1可以与STIM1和ORAI结合形成一个三原复合物［7］，通过调节SOCE来调控EPCs的增殖和迁移［8］。在早期的研究中已经有报道指出TRPC1是广泛参与血管系统的发展和功能的维护，如抑制TRPC的特殊位点来抑制血管损伤后的平滑肌细胞增生。而对于血管内皮祖细胞来说，Kuang等［9］发现可以通过两种RNA沉默的方法下调TRPC-1来抑制血管内皮祖细胞的增殖和迁移，他们在试验中通过RNA转染的方法敲除TRPC-1基因，结果SOCE被抑制，细胞周期停滞于G1期。从目前细胞基因表达的结果来看，循环PCR基因芯片显示，9个基因（AK1，BRCA2，camk2b，p21，DDIT3，INHA，slfn1，MDM2，和Prm1）可以上调，4个基因（BCL2，mki67，PMP22，和 ppp2r3a）表达下调，并且Kuang等［9］发现一个Schlafen 1-blocking peptide可以部分逆转非正常细胞的周期分布并诱导EPCs增殖和迁移。由此推断出TRPC1可能是诱导内皮祖细胞修复血管的新靶点，是一种调节EPCs生物学特性的新机制。

3.2ID1 ID1（inhibitor of DNA binding 1，DNA结合抑制因子）是HLH（helix-loop-helix，螺旋-环-螺旋）转录因子家族的成员之一，因为其缺乏HLH二聚体功能区外碱性DNA结合域，所以可以形成无功能异二聚体，对转录起负调节的作用。ID1在人体很多系统都可以参与增殖分化，而近年来，人们渐渐把目光投入到ID1与EPCs的关系中来。2007年Jankovic等［10］的试验就提示了ID1可能参与调控EPCs增殖形成新的血管，IDl缺失还可导致生成血管前基因，如整合素Q6的下调，由此抑制血管发生［11］。ID1已被证明可以增殖骨髓和脾源性的EPCs［12］。为了阐述清楚ID1是否是调控EPCs增殖的关键因子，它又是通过什么机制来调控的，国内外进行了大量的试验研究。

3.2.1ID1-E2-2途径 现有研究已揭示ID1主要通过两种途径参与细胞增殖调控。其一，ID1可与bHLH转录因子相结合，形成无功能的异二聚体阻断p53、p21基因的表达；或者与启动子区域的位点如E-box（CANNTG）、N-box（CACNAG）等结合，通过调节各种被激活的蛋白来调控。通过酵母双杂交技术，筛选小鼠文库，最终获得一个目的基因编码E2-2蛋白。早先Einarson等［13］的研究认为转录因子E2-2在神经系统的发育中起到促进神经增长的关键作用，2010年Ghosh等［14］的研究也证实E2-2可以促进成熟淋巴细胞增殖。之后的试验提示此蛋白属于E蛋白家族，可以与ID1结合形成二聚体来抑制bHLH，可能在血管内皮祖细胞的增殖与迁移中也起到重要作用。在内皮细胞的增长中有一种十分特殊的细胞因子（scular endothelial growth factor，VEGF）VEGF-2，它的缺乏可导致明显的血管生成障碍，提示其在传输细胞信号及促进内皮细胞的增殖、迁移等过程中是一个关键的受体。现有证据已经可以证明E2-2可以通过与VEGFR-2启动子特异性结合抑制成熟内皮细胞的增殖，将其敲除后内皮细胞增殖明显增强。

3.2.2ID1-P13K/Akt/NFkB途径 之前就有报道称ID1可能通过P13K/Akt/NFkB对肿瘤细胞的增殖起着重要的调控作用［15］。他们使用siRNA转染来抑制ID1的表达，显著降低PI3K/Akt和NFkB信号通路的表达。Li等［16］在体外试验中通过重组腺病毒载体表达ID1，同时使用小分子干扰RNA沉默ID1表达来做对照，并使用anti-P13K，anti-Akt，anti-NFkB抗体等对试验进行控制。结果显示使用Id1体外转染的内皮祖细胞诱导Akt通过PI3K的磷酸化，ID1刺激细胞增殖，上调p-PI3K，p-Akt蛋白，p-IJB，并可以通过NFkB通道增加凋亡抑制基因的表达，证实了ID1通过活化PI3K/Akt/NFkB/survivin通路来促进EPCs的增殖。Id1/PI3K/Akt/NFjB/survivin信号转导通路在EPC和肿瘤系统中的作用有许多相似之处，但是不像肿瘤细胞或组织，ID1，PI3K/Akt，NFkB，和Survivin在静态内皮祖细胞的基础表达几乎检测不到，在内皮祖细胞的生物学功能中ID1与PI3K/Akt/NFkB/survivin之间的关系在很大程度上是未知的，这也是以后的研究方向。

3.3bFGF和PDGF-BB 近年来的研究发现bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）和PDGF-BB（血小板源性生长因子）具有协同作用，可以促进血管内皮祖细胞的增殖和迁移。bFGF是成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）家族的一员，由于其等电点呈碱性且对酸和热敏感，故命名为碱性成纤维细胞生长因子。血小板衍生因子（PDGF）具有3种二聚体结构，PDGF-BB是其中之一，具有促进细胞群分裂与增殖的能力。两者基本原理都是依靠其受体激活下游的分子来起到调控作用。通常，人们认为PLC-C是与细胞增殖和分化等有关的关键分子［17］，Guo等［18］使用了PDGF受体激酶拮抗剂（AG1296）和选择性PLC抑制剂（U73122）作对照，评估了bFGF和/或PDGF-BB处理过的内皮祖细胞在缺少和有bFGF抗体存在的情况下PDGFRB mRNA的表达。结果有力地表明，碱性成纤维细胞生长因子可以触发PDGFRB mRNA的转录活性，bFGF和PDGF-BB可促进内皮祖细胞的增殖和迁移，特别是bFGF和PDGF-BB的协同作用影响更为显著。

4　讨论

由于篇幅所限，载脂蛋白A-I模拟肽D-4F通过eNOS/NO途径、雌激素通过雌激素受体和P13K途径、肝细胞生长因子的过表达等等促进血管内皮祖细胞增殖和迁移的方法不再一一赘述［19-21］。随着近年来研究的深入，人们对血管内皮祖细胞在各领域所能发挥的作用表现出了极大的关注。EPCs在血管损伤修复，靶向治疗，血管新生及生物学特性等都有着无可估量的使用前景。但是由于现有技术层面的局限，EPCs有限的增殖能力已是制约EPCs研究进展的一大瓶颈，其有没有更加特异性的表面标记，如何分离、纯化单个的EPC，提取出来的EPCs又如何保持体外增殖、迁移，这其中的机制又是如何还有待解答，所以未来的研究任务依然艰巨。

参考文献

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Research Progress in Proliferation and Migration of Endothelial Progenitor Cells

MA Yang，WANG Hong.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：133-136

【Abstract】The endothelial progenitor cells（EPCs）are precursor cells of vascular endothelial cells，which are also known as angioblasts.With the increase of vascular disease in recent years，the function and mechanism of endothelial progenitor cells in atherosclerotic stenosis and occlusive disease areas get more and more attention.However，its clinical application is limited to the poor proliferation capacity.Now we reviewe the latest developments in the proliferation and migration of endothelial progenitor cells in this article.

【Key words】Endothelial progenitor cells； Proliferation； Migration

*基金项目：国家自然科学基金（NSFC.NO.81270224）

通信作者：王红

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.038

收稿日期：（2015-12-31） （本文编辑：刘蕾）