KT对刺葡萄愈伤组织花青素含量的影响

赖呈纯，黄贤贵，黄金泽，潘 红，范丽华*，谢鸿根，王 琦

(1.福建省农业科学院农业工程技术研究所 350003；2.福建省农业科学院农业经济与科技信息研究所)

KT对刺葡萄愈伤组织花青素含量的影响

赖呈纯1，黄贤贵1，黄金泽2，潘 红1，范丽华1*，谢鸿根1，王 琦1

(1.福建省农业科学院农业工程技术研究所 350003；2.福建省农业科学院农业经济与科技信息研究所)

以长期保持的紫红色刺葡萄愈伤组织DLR细胞系为试验材料，研究不同KT浓度对其花青素和原花青素含量的影响，结果表明：KT可以有效调控刺葡萄愈伤组织花青素和原花青素的合成，其中以MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L培养基效果最佳，花青素和原花青素含量分别达到66.95 μg/g(FW)和3947.50 μg/g(FW)，分别是对照的2.44倍和1.68倍。

刺葡萄；6-糠氨基嘌呤(KT)；花青素；原花青素；愈伤组织

LAI Cheng-chun1, HUANG Xian-gui1, HUANG Jin-ze2, PAN Hong1, FAN Li-Hua1*, XIE Hong-Gen1, WANG Qi1

(1.InstituteofAgriculturalEngineeringandTechnology,FujianAcademyofAgriculturalSciences,FujianProvince350003；2.AgriculturalEconomyandScienceandTechnologyInformationResearchInstituteFujianAcademyofAgriculturalSciences,FujianProvince)

花青素和原花青素是清除人体自由基最有效的天然抗氧化剂，具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、保护心血管等方面的功能[1-3]。目前，天然的原花青素主要来源于松树皮和葡萄籽，随着市场需求的不断扩大，原有来源于葡萄、松树皮或其他替代植物的生物活性物质已不能满足市场需求，必须寻求更多更可靠的材料来源。植物细胞培养是生物技术领域的一个重要分支，是解决药用植物资源匮乏的有效途径[4]。然而，要通过细胞培养开展刺葡萄花青素生产，必须建立高含量花青素刺葡萄愈伤组织培养技术体系。本研究课题组曾对诱导产生并长期保持的两个同质不同型刺葡萄细胞系进行系列研究[5]，研究中发现，6-糠氨基嘌呤(KT)可显著提高刺葡萄愈伤组织花青素含量。为了进一步了解KT对刺葡萄愈伤组织花青素含量的影响，在前期研究的基础上，通过对培养基中KT浓度优化，以期大幅度提高刺葡萄愈伤组织细胞中花青素的含量，从而为葡萄花青素的规模化生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

以福建省农业科学院农业工程技术研究所葡萄研究室诱导并长期保持的紫红色刺葡萄愈伤组织DLR细胞系[5]为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 培养基配方处理 根据前期的研究，以刺葡萄愈伤组织同步化培养基M0为对照处理(MS+2,4-D 1.0 mg/L)，设计添加6种浓度KT的培养基配方，用于其对刺葡萄愈伤组织花青素含量影响的研究，具体配方如下，M1：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L，M2：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.10 mg/L，M3：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.50 mg/L，M4：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 1.00 mg/L，M5：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 1.50 mg/L，M6：MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 2.00 mg/L。以上培养基均加入蔗糖30 g/L、琼脂粉6 g/L，pH值调整为5.8左右。

1.2.2 刺葡萄愈伤组织的选择与预培养 为了使细胞旺盛生长并趋于同步化，需对细胞进行预培养，具体做法：选取长期继代培养过程中稳定显示紫红色的刺葡萄愈伤组织细胞系DLR，继代培养20 d 后，挑取愈伤组织细胞团表层略带部分里层的细胞作为接种材料，接种到未添加KT的M0培养基中培养20 d，作为下一步试验的接种材料。

1.2.3 刺葡萄愈伤组织接种与培养 选取预培养后的刺葡萄愈伤组织，接种到附加不同浓度KT的6种配方处理培养基中培养，并以在M0培养基中培养的刺葡萄愈伤组织为对照。每种培养基接种20瓶，设3次重复，培养25 d和35 d时分别收集愈伤组织，用液氮速冻后，于-80℃下保存，备用。

1.2.4 刺葡萄愈伤组织花青素与原花青素含量测定 刺葡萄愈伤组织花青素与原花青素含量测定参照赖呈纯等[5]的方法。

1.2.5 数据统计分析 试验数据采用DPS数据分析软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同培养天数和不同培养基对刺葡萄细胞花青素含量的影响

在预培养后的细胞中挑取合适大小的细胞团(表层略带部分里层的细胞)作为接种的材料，接种到6种配方处理的培养基中培养。培养25 d和35 d 时分别取样，测定细胞培养物中花青素含量，结果见表1。从培养天数变化来看，从培养25 d到35 d，花青素含量极显著升高。从不同培养基来看，培养25 d时，在KT浓度为0～2.0 mg/L范围内，随KT浓度的增加，刺葡萄细胞中花青素含量呈先增加后降低再增加的趋势，增加和降低的幅度较小，最高为M6培养基，达18.52 μg/g(FW)；其次是M2培养基，为18.18 μg/g(FW)；第三是M1培养基，为15.44 μg/g(FW)；含量最低是对照处理M0培养基，为8.92 μg/g(FW)；除M4培养基外，其他培养基配方处理的刺葡萄细胞中花青素含量均极显著高于对照处理的M0培养基。培养35 d时，在KT浓度为0～2.0 mg/L范围内，随KT浓度的增加，花青素含量也呈先急剧增加后迅速降低再增加的趋势，花青素含量最高的是M1培养基，达66.95 μg/g(FW)，并极显著高于其他培养基配方处理；其次是M6培养基，为50.60 μg/g(FW)；第三是M2培养基，为39.54 μg/g(FW)；最低的是M3培养基，为22.22 μg/g(FW)。从以上分析结果可以看出，当刺葡萄细胞在M1培养基中培养35 d时，最有利于其花青素合成，花青素含量高达66.95 μg/g(FW)，是对照处理M0培养基中刺葡萄细胞花青素含量的2.44倍。因此，刺葡萄细胞在MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L培养基中培养，可极大地提高其花青素含量。

表1 不同培养基中刺葡萄细胞花青素含量

注：①表中同列数据后无相同小写字母的表示差异显著(P<0.05)，无相同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；②按鲜重测定，下同。

2.2 不同培养天数和不同培养基对刺葡萄细胞原花青素含量的影响

本研究进一步考察不同培养基对刺葡萄细胞中原花青素含量的影响。分别取25 d和35 d的刺葡萄细胞培养物，测定细胞培养物中原花青素含量，结果见表2。从培养天数变化来看，从培养25 d到35 d原花青素含量极显著升高。从不同培养基来看，KT浓度在0～2.0 mg/L范围内，培养25 d时，原花青素含量随KT浓度的升高呈现先增加后降低的趋势，但增加和降低的幅度很小，在各培养基中培养的刺葡萄细胞原花青素含量除M1和M2与对照处理的M0培养基差异显著外，其余差异都不显著，原花青素含量最高的是M2培养基，为1433.65 μg/g(FW)；其次是M1培养基，为1406.48 μg/g(FW)；含量最低的是M0培养基，为1100.33 μg/g(FW)。培养35 d时，KT浓度在0～2.0 mg/L范围内，随KT浓度的增加，刺葡萄细胞中原花青素含量呈先急剧升高后迅速下降再缓慢升高的趋势，原花青素含量最高时对应的培养基是M1，为3947.50 μg/g(FW)；其次是M6培养基，为2789.65 μg/g(FW)；含量最低的是M4培养基，为1836.24 μg/g(FW)。从以上分析可以看出，在M1培养基中培养35 d的刺葡萄细胞，其原花青素含量极显著高于其他配方的培养基处理，高达3947.50 μg/g(FW)，是对照处理M0培养基的1.68倍。因此，刺葡萄细胞在MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L培养基中培养，可极大地提高其原花青素含量。

表2 不同培养基中刺葡萄细胞原花青素含量变化情况

3 小结与讨论

植物细胞培养具有不受季节影响、生长周期短、产物均一可控、活性物质含量高等优点，被认为是解决药用植物资源匮乏的有效途径。目前，植物细胞培养生产天然活性物质已经取得很大进展[6]。因此，建立刺葡萄细胞培养生产花青素的技术体系，有望为花青素生产提供丰富的原材料。然而，如何有效提高刺葡萄细胞中花青素的含量，仍是目前亟须解决的问题。有研究表明，适量的细胞分裂素KT可以促进植物细胞分裂和增殖，并增加细胞中次生产物的含量，Narayan等[7]的研究证明，在添加0.2 mg/L KT的培养基中培养，可较显著地增加玫瑰茄细胞花青素含量。本研究发现，添加KT可以有效地调控刺葡萄细胞中花青素的合成，培养基中添加不同浓度KT均可增加刺葡萄愈伤组织花青素和原花青素含量，以MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L培养基效果最佳，其花青素和原花青素含量分别是对照的2.44倍和1.68倍。该研究结果可为进一步进行刺葡萄细胞规模化培养生产花青素提供技术支撑。

[1]Thorne Research Inc.Oligomeric Proanthocyanidins (OPCs) (Monograph)[J].Altern Med Rev,2003,8(4):442-450.

[2]ZI S X,MA H J,LI Y,et al.Oligomeric proanthocyanidins from grape seeds effectively inhibit ultraviolet-induced melanogenesis of human melanocytes in vitro[J].Intern J Mol Med,2009,23:197-204.

[3]PRAPHASAWAT R,KLUNGSUPYA P,MUANGMAN T,et al.Antimutagenicity and antioxidative DNA damage properties of oligomeric proanthocyanidins from thai grape seeds in TK6 cells[J].Asian Pac J Cancer P,2011,12:1317-1321.

[4]DONNEZ D,JEANDET P,CLÉMENT C,et al.Bioproduction of resveratrol and stilbene derivatives by plant cells and microorganisms[J].Trends Biotechnol,2009,27(12):706-713.

[5]赖呈纯,范丽华,黄贤贵,等.刺葡萄幼胚愈伤组织诱导及其高产原花青素细胞系筛选[J].植物生理学报,2014,50(11):1683-1691.

[6]吕春茂，范海延，姜河，等.植物细胞培养技术合成次生代谢物质研究进展[J].云南农业大学学报,2007,21(1):1-5.

[7]NARAYAN M S,THIMMARAJU R, BHAGYALAKSHMI N.Interplay of growth regulators during solid-state and liquid-state batch cultivation of anthocyanin producing cell line ofDaucuscarota[J].Process Biochemistry,2005,40(1):351-358.

(责任编辑：杨小萍)

Effect of KT on anthocyanin content in callus of brier grape (VitisdavidiiFoёx)

Using the long-term maintained and purplish red callus of brier grape as test material, the effect of different KT concentration on its anthocyanin and proanthocyanidinscontent was investigated in this paper. The result showed that the anthocyanin and proanthocyanidins synthesis of brier grape callus could be regulated effectively by KT. The optimal medium was MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.05 mg/L, the anthocyanincontent and proanthocyanidinscontent were up to 66.95 μg/g(FW) and 3947.50 μg/g(FW), and they were 2.44 times and 1.68 times as control respectively.

Brier grape; 6-aminofurfurylpurine(KT); anthocyanin; proanthocyanidins; callus

2016-07-30

赖呈纯，男，1975年生，博士，副研究员。

*通讯作者：范丽华，女， 1957年生，副研究员 (E-mail：512264119@qq.com)。

福建省科技计划项目 ——省属公益类科研院所基本科研专项(2014R1015-6)；福建省自然科学基金项目(2016J01126)；福建省种业创新与产业化工程项目(FJZZZY-1520)；“十二五”农村领域国家科技计划项目(2013BAD01B05-7)。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2016.09.001