长沙一例猪疹块型红斑丹毒丝菌的分离与鉴定

2016-02-16唐爱明郑姣妹刘增再宁华杰

湖南畜牧兽医 2016年6期

关键词：丝菌疹块丹毒

唐爱明，陈智，郑姣妹，刘增再，宁华杰

（湖南省长沙市动物疫病预防控制中心，湖南长沙410013）

长沙一例猪疹块型红斑丹毒丝菌的分离与鉴定

唐爱明，陈智，郑姣妹，刘增再，宁华杰

（湖南省长沙市动物疫病预防控制中心，湖南长沙410013）

根据农业部NY/T566-2002猪丹毒诊断技术检验标准，通过全自动微生物鉴定系统，对送检的猪肉病料进行猪红斑丹毒丝菌检验，并对检验过程和结果进行分析，为动物源性食品中红斑丹毒丝菌等致病菌的检验提供依据，确保动物源性食品安全，为长沙市建设国家食品安全城市提供技术支撑。

猪肉病料；红斑丹毒丝菌；分离鉴定；食品安全

猪丹毒是由红斑丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）引起的一种急性败血症和亚急性疹块型疾病，俗称“打火印”或“鬼打印”[1]，为我国“三大猪传染病之一”。猪丹毒死亡率可达80％～90％,主要侵害架子猪，广泛流行于世界各地，对养猪业危害很大。我中心近期在长沙市某屠宰检疫中，发现皮肤上出现紫红色疹块猪病病例。按照农业部《NY/T566-2002猪丹毒诊断技术》检验标准[2]，对疑似猪丹毒病料进行检验，分离获得革兰氏阳性菌，生化鉴定结果显示为红斑丹毒丝菌。该菌是污染畜肉、禽肉等动物源性食品的病原菌，在兽医公共卫生学中具有重要意义。为确保肉品安全，建设长沙市国家食品安全城市构筑有效屏障，现将猪肉中红斑丹毒丝菌的分离、鉴定情况报告如下。

1试验材料

1.1被检材料

长沙地区某定点屠宰场发生有皮肤菱形疹块、疑似猪丹毒的病例，病猪体温升高41℃～42℃，精神不振，不愿走动，猪胸、腹、背、四肢的皮肤上发生疹块，呈方形或菱形，稍凸起于皮肤表面[3]。采集菱形疹块猪肉、肝脏、肺脏、淋巴等组织病料进行检验；心脏制备抹片，染色镜检，为革兰氏阳性细小杆菌，[4]见图1。

1.2培养基

马丁琼脂、马丁肉汤试剂均购自北京陆桥微生物制剂有限公司。普通绵羊血平板、巧克力平板、营养琼脂平板（NA）均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3细菌鉴定卡

GP革兰氏阳性细菌鉴定卡，法国梅里埃公司出品，批号：242372110，有效期限：20170220；AST-GP69革兰氏阳性细菌药敏卡，生产批号：134351420，有限期限：20160728。

1.4细菌鉴定仪

全自动微生物鉴定/药敏分析系统（法国梅里埃公司出品，型号：VITEK2 COMPACT15）。质控菌株：金黄色葡萄球菌，菌株编号为CICC21600；大肠埃希氏菌，菌株编号为CICC10389，均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。定期做质量控制，质控结果完全符合。

2病原的分离

2.1细菌的分离培养

采集发病猪皮肤疹块、肝脏、心脏病料，无菌接种于普通绵羊血平板、巧克力平板，37℃培养18～24h。对分离细菌进行纯化，染色镜检[5]。根据镜检初步结果，选取疑似菌株进行营养琼脂和马丁肉汤液体培养基培养，分别命名为PF-1、GZ-2、XZ-3，分离部位分别为皮肤、肝脏、心脏，37℃培养18～24h。

2.2菌落的形态及染色

三株分离菌PF-1、GZ-2、XZ-3培养特性、菌体形态、染色特性基本一致。在普通绵羊血平板上生长缓慢，菌落较小，表面圆整光滑湿润，边缘整齐，呈微蓝灰色露珠状，呈α-溶血，菌落周围形成草绿色的溶血环。普通绵羊血平板和马丁肉汤培养的细菌，染色镜检，显示菌体革兰氏染色为阳性。固体培养基菌体呈球状、短杆状，单个或双菌存在，见图2；液体培养基菌丝成丝状，见图3。

（革兰氏染色，1000×）图1 心脏触片高倍镜检

（革兰氏染色，1000×）图2 血琼脂培养菌体形态

（革兰氏染色，1000×）图3 肉汤培养菌体形态

2.3细菌的纯化及初步鉴别

取血琼脂平板溶血菌分别接种于胰酪胨大豆肉汤液体培养基、营养琼脂平板（NA），37℃培养24h。肉汤培养管均匀混浊,管底有灰白色长丝状菌体；普通营养琼脂上的菌落,无色透明,表面光滑,圆形较为扁平、粘稠；取NA平板新鲜菌做三糖铁琼脂（TSI）、接触酶试验、葡萄糖产气、V-P试验，观察结果见表1[6]。

表1 丹毒丝菌属生化反应初步鉴别表

3细菌的鉴定

3.1鉴定卡选择

根据菌种革兰氏染色结果，选取GP革兰氏阳性菌鉴定卡和AST-GP69革兰氏阳性细菌药敏卡进行检验。

3.2菌悬液配制及稀释

取TSA琼脂平板37℃培养18～24h新鲜菌于0.45％氯化钠悬浮液并混匀，校正比浊仪，保证测定数值在规定范围内。测定菌液浓度，菌悬液浓度为0.5～0.63麦氏单位，按操作说明进行稀释，配制相应浓度药敏卡菌悬液。

3.3生化和药敏鉴定

将三株分离菌PF-1、GZ-2、XZ-3编号，按顺序放在载卡架上，药敏卡放在配对鉴定卡后面。按细菌鉴定仪操作要求，取37℃营养琼脂培养18～24h的新鲜菌，上全自动微生物鉴定/药敏分析系统进行鉴定[7-8]。

3.3.1生化鉴定结果：鉴定卡按正常程序放入VITEK 2 COMPACT孵育箱后，仪器经过4～8h的孵育和判读，由工作电脑给出相应鉴定结果。PF-1、GZ-2、XZ-3为红斑丹毒丝菌，可能性（Probability）99％，置信度（Confidence）极度一致（Excellent identification），为相当好的鉴定。生化鉴定结果见表2。

表2 三株细菌生化鉴定结果

3.3.2药敏鉴定结果：

AST-GP69革兰氏阳性细菌药敏卡鉴定结果显示，三株细菌的药敏特性基本相同：对青霉素类药物（氨苄青霉素、青霉素G、苯唑青霉素）、氯霉素类药物（氯霉素）、喹诺酮类药物（恩诺沙星、麻保沙星）、大环内酯类药物（红霉素）、林可霉素类药物（克林霉素、卡拉霉素）、抗分枝杆菌药物（利福平）敏感；对氨基糖苷类药物（庆大霉素、卡那霉素）、多肽类药物（万古霉素）、硝基呋喃类药物（呋喃妥因）、磺胺类药物（复方磺胺甲恶唑）、四环素类（四环素）耐药。药敏结果见表3。