糜子雄性不育突变体的创制和遗传分析

李海权，相金英，韩玉翠，降彦苗，耿玲玲，程汝宏，刘国庆

（河北省农林科学院谷子研究所，河北省杂粮重点实验室，国家谷子改良中心，河北石家庄050035）

糜子雄性不育突变体的创制和遗传分析

李海权，相金英，韩玉翠，降彦苗，耿玲玲，程汝宏*，刘国庆*

（河北省农林科学院谷子研究所，河北省杂粮重点实验室，国家谷子改良中心，河北石家庄050035）

杂种优势是培育高产、优质、高抗作物新品种的主要手段，而雄性不育系的选育直接决定着作物杂种优势育种的成功。利用60Co-γ射线诱变首次创制出糜子（Panicum miliaceum，2n=4x=36）雄性不育突变体M207A，并对其进行了育性鉴定和初步的遗传分析，目的是利用该突变体进行糜子杂交种的选育、在糜子中实现杂种优势的利用。首先采用室内花粉镜检与田间调查相结合的方法对突变体进行了育性鉴定；将突变体与育性正常的糜子品种配组杂交获得的F1和F2群体在不同地点、不同年份、不同季节种植，对不育突变体的遗传模式进行了分析。结果表明：不育株花药褐化，无外露，花药干瘪，不育度在95%以上，不育性状稳定；利用育性正常的品种给稳定的突变体进行授粉，其结实率可达到正常水平；自交F2群体中育性分离比例为35∶1，符合单基因座位上同源四倍体基因的理论分离比，说明该突变性状是由隐性单基因控制的可遗传的“无花粉型”细胞核雄性不育。雄性不育突变材料M207A的创制，为糜子杂种优势利用奠定了材料基础。

糜子；辐射诱变；雄性不育突变体；遗传分析；杂种优势利用

植物雄性不育（plant male sterility）是植物在有性繁殖过程中由于生理或遗传上的原因造成植物雌性器官正常而雄性器官不正常，不能产生花粉或花粉败育而不能授粉结实的现象。雄性不育类型有很多种，依据不育基因的遗传方式和在细胞中的定位可分为细胞核雄性不育和细胞质雄性不育2种。利用雄性不育进行杂交制种，是提高杂交制种效率、节约制种成本、保证制种质量的一条经济且有效的途径[1]。雄性不育材料是作物遗传研究和育种利用的宝贵资源，是充分利用杂种优势的材料基础和前提，因此，雄性不育材料的发现与创制对于杂种优势的成功利用和雄性不育的遗传机理研究具有决定性的意义。前人在玉米[2～4]、水稻[5～8]和谷子[9～11]等多种作物中对雄性不育性状开展了广泛的研究和应用，但截至目前，在糜子（Panicum miliaceum，2n=4x=36）中还未见到雄性不育材料的报道，也未实现杂种优势的利用。糜子起源于我国的黄河流域，迄今最早的人工栽培遗迹发现于河北省武安市的磁山文化遗址，已有10 300 a的历史[12]。糜子是干旱半干旱地区的重要农作物，也是新垦土地的先锋作物和理想的复种作物，具有丰富的营养价值，是重要的食疗保健植物资源。我国是世界上糜子栽培面积最大的国家，长期以来，糜子作为重要的经济和粮食作物主要分布在北方旱作区域，但由于产量不高、经济效益一般，导致糜子种植面积日趋减少，目前我国的糜子年平均种植面积为73.33万～80.00万hm2[13]。另外，糜子品种改良技术落后，育种方法仍以系统选育和地方品种认定为主，尽管近年来开展了常规杂交育种工作，但是目前仍然存在品种单产水平较低、更新换代迟缓等问题。因此，进行育种方案调整，充分发掘杂种优势潜力，加快新品种的选育进程成为当前糜子育种的关键性任务。

作者通过辐射诱变的方法首次在糜子中创制了雄性不育突变材料，并对其进行了初步的遗传分析，可为利用杂种优势加快糜子的品种改良、提高产量、促进糜子产业的快速提升发挥重要作用，也可为进一步探讨作物杂种优势机理提供材料基础和契机。

1 材料与方法

1.1 雄性不育突变体的获得

2009年选用糜子育成品种雁黍5号和张家口农家种二紫杆的育性种子，在河南省辐射加工工程研究中心进行不同剂量的60Co-γ射线辐射诱变。诱变种子在河北省农林科学院谷子研究所试验站进行田间种植，获得M1代单株并保存。2010年5月在河北省农林科学院谷子研究所试验站（石家庄栾城）穗行种植M1代，成熟时调查育性突变情况，在M207家系中分离出不育株，单株收获保存。2011年5月在河北省农林科学院谷子研究所试验站（石家庄栾城）株行种植M2代，调查不育突变材料的稳定性及突变率，收获单株；并于2011年冬季在海南省南红农场实验站和2012年春夏季在河北省农林科学院谷子研究所实验站（石家庄栾城）温室及大田连续套袋自交3代，继续选择自交可育株种植下一代，并调查不育突变材料的稳定性及突变率，将此过程中获得的稳定不育材料称为M207A。

1.2 田间试验与性状调查

2013～2014年连续2 a将M207A与糜子品种晋黍9号杂交配组，在河北省农林科学院谷子研究所试验站（石家庄栾城）、张家口蔚县和海南省南红农场均种植亲本以及F1和F2材料。田间种植30株/行，株行距10 cm×30 cm，其他田间管理措施同一般大田。自抽穗期开始，进行育性调查。成熟期，考查M207A及其野生型的主要农艺性状，包括株高、剑叶长、剑叶宽、单株穗数、穗长、穗伸出度、每穗着粒数、结实率、千粒重等。

1.3 花粉育性鉴定

在糜子幼穗期，分别取M207A和雁黍5号尚未开花的小穗，在OLYMPUS SZX12显微镜下观察花药及柱头的生长发育情况，在OLYMPUS BX61荧光显微镜下观察花粉粒的发育情况；从每个穗子的中上部枝梗中选取当天将开的颖花3朵，用1%的KI-I2染液染色，在显微镜下观察，根据花粉粒形态和染色状况，分析可育和败育的花粉及败育类型。

2 结果与分析

2.1 M207A的育性鉴定

图1 不育突变体材料M207A（A）与对照雁黍5号（B）的花药比较Fig.1 Comparison of anthers from the sterile mutant M207A（A）and wild type Yanshu No.5（B）

M207A植株开花时，花药小、不开裂，且花药在开花前变黑，不伸出（图1-A，封三）；而野生型雁黍5号的正常可育花药呈黄色，开花时伸出颖壳，并包含有大量的花粉粒（图1-B）。对二者的花粉采用碘染法染色后进行育性镜检发现，M207A花粉数量少，且活力低（图2-A和B）；而雁黍5号正常花粉粒多且染色深，活力旺盛（图2-C和D）。M207A田间套袋自交结实率平均为3.1%。同时，用晋黍9号、疙瘩黍等育性正常的品种给M207A授粉，其结实率可达到正常水平，说明不育突变材料的雌性花器正常。另一方面，分别在海南三亚和张家口蔚县观察不同播期M207A的小穗育性，结果显示，该不育突变材料在不同光周期和温度条件下均表现相似的不育性，说明M207A不育特性稳定，受光、温等环境因素影响较小。

2.2 M207A的遗传分析

M207A与晋黍9号杂交的F1植株表现完全可育，表明不育性状受隐性基因控制。如果是受单基因控制，二倍体杂种的自交后代有3种基因型，显隐性比例为3∶1。糜子是同源四倍体，在同一位点上有4个等位基因，它与育性正常糜子品种杂种后代的基因型种类和表现型比例要比二倍体复杂得多。以双显性AAaa为例，其自交后代有5种基因型，显隐性比例将依染色体、染色单体随机分离和完全均衡分离分别表现为35∶1、20.8∶1和19.3∶1这3种分离类型[14]。

统计F2群体中可育株与不育株的数量（表1），经χ2检测，可育植株数与不育植株数符合35∶1的分离比例，表明M207A雄性不育性状由单隐性核基因控制，且可育性状对不育性状表现为完全的显性。

图2 不育突变体材料M207A及野生型雁黍5号的花粉KI-I2染色结果Fig.2 Pollen staining with KI-I2solution from the sterile mutant M207A and wild type Yanshu No.5*A：M207A，20X；B：M207A，40X；C：雁黍5号，20X；D：雁黍5号，40X。

3 结论与讨论

用辐射方法诱导突变是选育植物新种质快速、有效的方法之一，不仅可以快速创造新材料、新种质，而且不存在安全隐患[15]。研究表明，电离辐射可以诱导株高、生育期、抗性、叶型、育性及品质等性状发生变异，结合育种目标进行鉴定和选择，能达到创制新种质和辅助品种选育的目的[16～20]。60Co-γ射线是电离辐射中应用最多的射线，已成为传统的创造新材料、新种质和诱变育种方法。本研究利用60Co-γ射线处理糜子品种雁黍5号的种子，在其诱变后代中经自交选育，创制出了糜子雄性不育的新种质M207A。该新种质在叶型、叶色、株高、茎粗、茎节数及单株穗数等营养生长方面并没有出现明显的变化，但在生殖生长时期花药发育异常，外观表现为花药变小、褐化、不开裂且不伸出颖壳，碘染试验发现花粉粒发育异常，成熟花粉数量少且活力低下，属于败育性花粉中较严重的碘败型花粉。M207A的创制也证明了辐射诱变是拓展作物种质基础的一条有效途径。

表1 M207A与晋黍9号杂交后代F2群体的育性分离统计Table1 Fertility segregation statistics in the F2population from M207A/Jinshu No.9

杂种优势是培育高产、优质、高抗作物新品种的主要手段，而利用雄性不育系进行杂交育种是杂种优势利用的经济、有效途径之一；作为杂种优势利用的关键步骤，雄性不育系的选育直接决定着作物杂种优势育种的成功[21]。对新创制糜子不育材料M207A进行初步的遗传分析，结果表明，控制其不育性状的是单隐性基因，在该不育材料与育性正常品种晋黍9号杂交的F2群体中表现35∶1的分离比例。今后，还需要利用其F3及回交群体进行进一步的验证。M207A不育度较高，但仍有3%～5%的自交结实率，因此，不需要寻找其保持系；且与育性正常糜子品种杂交，F1代育性正常，配组自由，易于选育出杂种优势高的组合。但是该不育系也存在缺点，表现为在杂交制种时易出现不育株和可育株田间混杂，造成杂种不纯等问题。因此，应用隐性核不育基因的关键是能够有效区分不育株和可育株，传统的鉴别方法包括形态标记鉴定如玉米和谷子上的黄白粒系统[22]和黄绿苗标记体系[9]及抗除草剂基因连锁等[23，24]。近年来SPT（seed production technology）技术已成功地用于玉米杂交种的生产中，该技术利用现代生物技术，组合花粉失活基因、花粉育性恢复基因和红色荧光蛋白标记基因，以此来构建遗传转化载体，并将其导入玉米隐性核雄性不育系中，通过机械色选技术将颜色不同的不育株和可育株种子分离开[25]。随着分子生物学研究的不断发展，结合不断涌现的新方法和新技术，隐性核不育基因的应用前景将越来越广阔。

生殖发育是植物发育中很重要的过程，涉及到花粉减数分裂、绒毡层降解、花粉壁形成、花药开裂、花粉管伸长、双受精等一系列的生物学过程。研究表明，造成雄性不育的核基因有很多，仅在水稻中就发现了控制雄性不育的核基因有18个，分别涉及到染色体联会相关、绒毡层发育相关、花粉形成等发育相关等过程[5]；在其他不同的植物中，也发现了很多控制雄性不育的核基因[11]。新雄性不育基因的不断发现，必将进一步提升我们对雄性不育的认识，也促进雄性不育系的培育和育种利用。同时，随着分子生物学技术的进步和研究手段的不断更新，对植物雄性不育机理的认识也变得更加全面和深刻[26～28]，如近年来随着高通量测序技术的迅猛发展，通过转录组测序技术从RNA水平对植物雄性不育机制进行解析的研究报道逐渐增多，在水稻、小麦、玉米、棉花等20多个物种中，利用测序技术从转录水平分析了包括多种败育类型的生殖发育及雄蕊败育的机理，包括细胞核雄性不育（genic male sterility，GMS）[29，30]、细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）[31，32]、化学诱导雄性不育（induced male sterility）[33]、光敏雄性不育（photoperiod sensitive male sterility，PGMS）[34]和温敏雄性不育（thermosensitive male sterility，TGMS）[35]等；利用二代测序技术，结合分子生物学与生物信息学分析测序数据，找出候选突变基因，大大缩短了基因克隆时间，降低了基因克隆成本，也实现了雄性不育基因的精细定位和克隆[36]。因此，充分利用组学技术获得的大数据而提供的丰富信息将为进一步解析植物雄性不育机理提供强有力支持[37]。

糜子是主要的粮食作物之一，具有耐旱、耐瘠、耐盐碱性强、成熟早等特点，且养分需求量低，籽粒养分合理，营养价值高，在我国的杂粮生产中占有重要地位[38]。但截至2010年，我国的糜子育成品种只有100多个，其中系统选育品种占到近半数，和地方品种认定一起，占到了63%[13]，说明我国糜子育种水平较低，在小麦、谷子、水稻中广泛应用的杂交育种在糜子中应用得还不多，更谈不上杂种优势利用。M207A为糜子中首次创制的雄性不育材料，为今后培育糜子杂交种和杂种优势利用奠定了坚实的遗传基础。

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The Creation and Genetic Analysis of a Male Sterility Mutant in Panicum miliaceum

LI Hai-quan，XIANG Jin-ying，HAN Yu-cui，JIANG Yan-miao，GENG Ling-ling，CHENG Ru-hong*，LIU Guo-qing*
（Institute of Millet Crops of Hebei Academy of Agricultural&Forestry Sciences，Key Laboratory of Minor Crops in Hebei，The National Foxtail Millet Improvement Center，Shijiazhuang 050035，China）

Heterosis plays an important role in development of new crop varieties with high-yielding，goodquality and biotic/abiotic stresses while male sterile line development is the key step to determine the success of heterosis utilization.A male sterile mutant，M207A was created in proso millet（Panicum miliaceum，2n=4x=36）for the first time using60Co-γ ray mutagenesis.Fertility identification and genetic analysis were carried out to characterize the mutant for its possible use for heterosis utilization in proso millet.First the sterility was investigated using both field survey and indoor pollen microscopy identification.Then Pollinated by normal fertile proso millet cultivars，F1and F2populations from the mutant were obtained.Meanwhile primary genetic analysis was also conducted using above populations in different experimental sites，seasons and years.The results showed that the male sterile plant exhibited closed glumes，browning and dry anthers with few normal pollens.The sterility was stable and sterility ratewas above 95%on average.The segregation ratio of fertile to sterile plants was 35∶1 in the fertile selfing F2population indicating that the mutant was a genic male sterility belonging to a pollen-less type controlled by a single recessive gene.The creation of the mutant，M207A can play a key role for heterosis utilization in proso millet.

Panicum miliaceum；Radiation mutagenesis；Male sterile mutant；Genetic analysis；Hoterosis utilization

S516

：A

：1008-1631（2016）06-0001-05

2016-07-10

国家科技支撑计划项目（2014BAD07B03）；河北省财政专项（2016023668）

李海权（1977-），男，河北乐亭人，副研究员，硕士，主要从事植物分子遗传育种研究。Tel：0311-87670695；E-mail：lihaiquan77@aliyun.com。

程汝宏（1963-），男，河北卢龙人，研究员，硕士，主要从事谷子、糜子遗传育种研究。Tel：0311-87670697；E-mail：rhcheng63@126.com。

通讯作者：刘国庆（1964-），男，河北沧州人，研究员，博士，主要从事植物分子遗传育种研究。Tel：0311-87670695；E-mail：guoqingliu@hotmail.com。