高速逆流色谱法一次性分离制备藏药蓝玉簪龙胆中的三个化合物

李 姗，赵 野，刘 圆，张志锋

(1.西南民族大学药学院；2.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041)

高速逆流色谱法一次性分离制备藏药蓝玉簪龙胆中的三个化合物

李 姗1，赵 野1，刘 圆2，张志锋2

(1.西南民族大学药学院；2.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041)

目的:通过高速逆流色谱法(HSCCC)从藏药材蓝玉簪龙胆中分离制备得到三个高纯度化合物.方法:选择乙酸乙酯-正丁醇-水(4:0.5:5，v/v/v)为二相溶剂系统，上下两相分别作为固定相、流动相，主机转速设置为900 r/min，流动相溶剂流速为2 mL/min，紫外检测波长为254 nm，柱温为20℃.所采集的组分减压浓缩后烘干得到龙胆苦苷、异荭草素、异牡荆苷，应用ESI-MS/MS分析鉴定，并用HPLC测定其质量分数.结果:在260 min内可一步纯化150 mg藏药材蓝玉簪龙胆水粗提物中的龙胆苦苷、异荭草素、异牡荆苷，三者完全分离，纯度分别达到98.2%、94.5%、96.0%.结论:利用高速逆流色谱法可快速、简单、高效地富集蓝玉簪龙胆中龙胆苦苷、异荭草素、异牡荆苷三种化合物.

高速逆流色谱；蓝玉簪龙胆；龙胆苦苷；异荭草素；异牡荆苷

藏药蓝玉簪龙胆为龙胆科龙胆属植物蓝玉簪龙胆(Gentianaveitchiorum Hemsl.)的干燥地上部分，藏语学名为“邦见温保”[1-2].性寒、味苦；归肝、胆经；具清热解毒功效；现代药理研究表明蓝玉簪龙胆可减轻肝肺部的炎症，保护肝肺功能，抑制肝肺纤维化的形成[3-4].龙胆中主要化学成分是裂环烯醚萜苷及黄酮类化合物，杨红澎等使用传统分离方法从蓝玉簪龙胆花中分离鉴定了2α-羟基熊果酸、落干酸、远志脑苷(polygalacerebroside)、熊果酸、龙胆苦苷、异荭草素-3′-甲醚、异牡荆苷和异荭草素等化合物[5-6].

高速逆流色谱(HSCCC)[7]是一种连续高效的快速液-液分配色谱分离技术，具有回收率高，连续高效，制备量大等特点，可直接用于分离制备粗提物[8-9].该法中化合物的分离只依赖于溶解性的不同，由此避免了因不可逆性吸附造成的样品损失及由于表面化学等诸因素引起的化学分析物变性，因而广泛应用于天然产物中活性物质的分离制备[10-11].本实验采用高效逆流色谱建立分离制备蓝玉簪龙胆中的三种化合物的方法，该操作简单，分离时间短，产物纯度高，对蓝玉簪龙胆化合物的分离及其药理药效的进一步研究具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高速逆流色谱仪(TBE-300B，TBE-20A，上海同田生化技术有限公司)；Waters e2695高效液相色谱仪，含Waters 2489紫外/可见光分光光度检测器，Empower色谱工作站、自动进样器、四元梯度泵、柱温箱. UHPLC–PDA–QTOF–MS为Waters Acquity UHPLC I-Class系统(Waters，USA).质谱为双重四级杆飞行时间质谱和电喷雾电离质谱(ESI)(Waters MS Technologies，UK).

藏药蓝玉簪龙胆采于四川省红原县，由四川大学张浩教授鉴定为龙胆科龙胆属植物蓝玉簪龙胆(Gentianaveitchiorum Hemsl.)全草；HSCCC分离所用的乙酸乙酯、正丁醇均为分析醇；HPLC分析中所用甲醇为色谱醇，水为超纯水；D101大孔树脂(西安蓝晓科技有限公司).

1.2 方法

1.2.1 蓝玉簪龙胆粗提物的制备

将干燥的蓝玉簪龙胆2 kg粉碎，用75%乙醇浸泡3次，每次3 d，料液比为1∶20；过滤，滤渣纯水回流提取两次；滤液过D101大孔树脂，依次用水，10%，30%，50%，70%，100%六个梯度乙醇-水洗脱，分段收集洗脱液；减压浓缩.将浓缩得到的浸膏冷冻干燥至粉末，得到乙醇粗提浸膏及水粗提浸膏，干燥器中保存备用.准确称取150 mg水粗提物溶解于10 mL下相，4℃下保存备用.

1.2.2 HPLC及UHPLC-PDA-QTOF-MS色谱分析条件

采用HPLC法对HSCCC分离的各组分进行检测，并按照面积归一化法判断各组分的纯度.色谱柱: YMC-Triart C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇(A)-水(B)为流动相梯度洗脱(0～50 min，20%～50%A)；进样量为10 μL；流速:1 mL·min-1；检测波长:240 nm；柱温:35℃.

采用UHPLC–PDA–QTOF–MS为结构鉴定，根据二级质谱碎片推测化合物结构.色谱柱:Acquity HSS C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，0.1%乙酸水(A)和甲醇(B)为流动相，0～15 min，20～50%B梯度洗脱；进样量为1 μL；流速:0.2 mL· min-1；检测波长240 nm；柱温:35℃.

质谱量子范围，m/z100～1 500；干燥气体的流量(N2)、800 L/h；干燥气体温度450℃；氮气，30 L/h；离子源温度100℃；毛细管电压2 500 V和筒内压力40 V.

1.2.3 溶剂体系选择

根据待分离物质的物理性质及溶剂极性，确定选用乙酸乙酯-正丁醇-水为两相溶剂体系，配置两相溶剂不同体积比(7∶0∶5，4∶0.5∶5，4∶1∶5，7∶1∶5)的溶剂体系.上相为固定相，下相为流动相，充分混匀后平衡6-10h，超声脱气20min，紫外检测波长为254nm.根据文献[12]计算分配系数K＝Aupper/Alower，K值结果见表1.

表1 蓝玉簪龙胆主要成分分离的HSCCC溶剂系统优化结果Table 1 Optimization of the solvent systems of HSCCC

1.2.4 高速逆流色谱分离制备

经过优化筛选出乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂体系，将其充分混匀后再静置分层，上下两层分别为固定相、流动相.固定相溶剂以20 mL/min的流速泵入HSCCC螺旋管柱中，等到固定相溶剂流出约20 mL后停泵.主机设置为正转，转速调至900 r/min，再以2 mL/min的流速泵入流动相溶剂，待流动相溶剂流出且达到两相动态平衡时，将100 mL水粗提物样品注入HSCCC仪中，打开色谱工作站采集数据:检测波长为254 nm，柱温为20℃.监测色谱图并收集各组分，浓缩后烘干.

2 结果与分析

2.1 蓝玉簪龙胆水相粗提物的HPLC分析

图1 蓝玉簪龙胆水相粗提物的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of crudeextract from Gentiana veitchiorum Hemsl.

由图1可知，HPLC外标法分析蓝玉簪龙胆水相粗提物，测得提取物中三个化合物的含量分别为

33.2%，36.5%，24.0%.

2.2 HSCCC分离制备结果

由表1可知乙酸乙酯-正丁醇-水(4∶0.5∶1)为最优溶剂体系，经微调后直接进行制备，分离谱图见图1，在该条件下，可分离出三个化合物，且重现性良好.

图2 制备型HSCCC分离蓝玉簪龙胆中三种化合物色谱图Fig.2 Chromatograms ofthree compounds from Gentiana veitchiorum Hemsl.by preparative HSCCC

2.2 纯度分析及结构鉴定

组分I，II，III，IV减压浓缩后烘干分别得到23.2 mg，11.6 mg，5.1 mg，6.8 mg粉末，精确称取各组分3 mg，甲醇溶解后制成1 mg/mL样品，以1.2.2节中的色谱条件对收集的各组分进行检测，采用HPLC外标法测定，得到组分I为杂质，组分II纯度98.2%，组分III纯度94.5%，组分IV纯度96.0%.对三个组分采用ESI-MS/MS分析鉴定化合物(见图3-II)，组分II分子离子峰为[M-H＋COOH]－m/z 401.1084，分子式鉴定为C16H20O9，基于CID-MS2显示碎片峰为m/z 391.0801，376.0054，225.0128，179.0558，149.0548，112.9838质谱图数据与文献(13)中报道的龙胆苦苷质谱数据一致，分析鉴定结构为龙胆苦苷(如图3-II).

组分III分子离子峰为[M－H]＋m/z 447.0925，分子式为C21H20O11，基于CID-MS2显示碎片峰为m/ z285.0393，可能为[M－H－162]－，即脱去一个糖；碎片峰m/z 429.0815可能为苯环上两个羟基的缩合；碎片峰m/z 327.0503是失去一分子水和一分子P-hydroxyPhenyl-prop-enyl后得到，质谱图数据与文献(14-15)中报道的异荭草素质谱数据一致，即鉴定结构为异荭草素(如图3-III).

组分IV分子离子峰为[M－H]－m/z 431.0976基于CID-MS2显示碎片峰为m/z 311.0548，295.0601，283.0601，269.0441，161.0244，117.0335，与文献(16)中报道的异牡荆苷质谱数据一致，即鉴定结构为异牡荆苷(如图3-IV).

图3 制备型HSCCC分离蓝玉簪龙胆中三种化合物的质谱图(组分II-IV:龙胆苦苷，异荭草素，异牡荆苷)Fig.3 MS of three compounds from Gentiana veitchiorum Hemsl.by preparative HSCCC (LYZ-II～IV:gentiopicroside，isoorientin and isovitexin)

3 讨论

本实验采用高效逆流色谱实现了蓝玉簪龙胆中三种主要成分龙胆苦苷，异荭草素，异牡荆苷三种不同化合物的完全分离.通过多次验证获得最佳HSCCC分离体系为乙酸乙酯-正丁醇-水(4:0.5:5，v/v/ v)，并成功通过一步纯化从150 mg蓝玉簪龙胆水相粗提物中获得龙胆苦苷，异荭草素，异牡荆苷三种不同化合物，纯度分别达到98.2%，94.5%，96.0%，分离时间260 min.龙胆苦苷是中国药典规定的龙胆类植物中的标志性成分，具有广谱的药理活性，黄酮类化合物也以成为国内外天然产物研究热点，本文中分离得到的两个黄酮类化合物在蓝玉簪龙胆水提物中含量很高，因此对蓝玉簪龙胆中的黄酮类物质研究具有较大的实用价值.本文方法可以一步纯化得到高纯度的龙胆苦苷和黄酮类化合物，更省时、简便，可为蓝玉簪龙胆的化合物纯化分离及其药理作用的进一步研究提供物质基础.

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(责任编辑:李建忠，付强，张阳，罗敏；英文编辑:周序林，郑玉才)

Separation and preparation of three compounds from Gentiana veitchiorum by high-speed counter-current chromatography(HSCCC)

LI Shan1，ZHAO Ye1，LIU Yuan2，ZHANG Zhi-feng2*
(1.Pharmaceutical School，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.；2.Institute of Qinghai-Tibetan Plateau，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

Objective:To separate and purify three compounds from Gentiana veitchiorum Hemsl by high-speed counter-current chromatography(HSCCC).Methods:The solvent system of HSCCC was composed of ethyl acetate，n-butyl alcohol and water，in which the upper was the stationary phase，and the lower was the mobile one.The flow rate of mobile phase was 2 mL/min，and the revolution speed was set at 900 r/min with the column temperature of 20℃and detection wavelength of 254 nm.The three compounds of gentiopicroside，isoorientin and isovitexin were obtained after vacuum concentration and drying，followed by determination through HPLC method，and their chemical structures were identified by ESI-MS/MS method.Results:High purity gentiopicroside(98.2%)，isoorientin(94.5%)and isovitexin(96.0%)were obtained from 150 mg of water crude extract through one-step separation and enrichment during 260 min.Conclusion:HSCCC method could be used for the preparation of three different compounds(gentiopicroside，isoorientin and isovitexin)from Gentiana veitchiorum Hemsl，and the method was simple，quick and efficient.

high-speed counter-current chromatography；Gentiana veitchiorum Hemsl；gentiopicroside；isoorientin；isovitexin

R284

A

2095-4271(2016)06-0660-05

10.11920/xnmdzk.2016.06.011

2016-05-16

张志峰(1973-)，男，汉族，四川人，副教授，博士.研究方向:中药学.E-mail:zhangzhf99＠gmail.com

四川省科技厅应用基础研究项目(2014JY0233)