温和气单胞菌对齐口裂腹鱼血浆中抗氧化酶的影响

赵 静，王 利，钟红梅

(1.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041)

温和气单胞菌对齐口裂腹鱼血浆中抗氧化酶的影响

赵 静1，王 利2，钟红梅2

(1.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041)

为探讨温和气单胞菌对齐口裂腹鱼抗氧化能力的影响，采用人工回感实验对齐口裂腹鱼注射温和气单胞菌，在6个不同时间点测定4个血浆指标:总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶活性(T-SOD)和黄嘌呤氧化酶(XOD).结果表明:齐口裂腹鱼在感染48h后出现明显症状，与对照组相比，感染组血浆T-SOD活力在感染12 h后上升出现差异极显著(P＜0.01)，但在24 h后显著下降.T-AOC在感染初期出现上升，48 h呈极显著性升高，随后下降.CAT活性在感染初期明显增强，48 h时出现极显著性差异(P＜0.01)，但72 h后开始下降.XOD活性在感染24 h后呈上升趋势.这有利于深入研究温和气单胞菌对鱼类的致病机理.

抗氧化酶；温和气单胞菌；齐口裂腹鱼

齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)属鲤科，裂腹鱼亚科，是四川和青藏高原地区特有的经济鱼类之一.近年来，随着齐口裂腹鱼人工养殖规模的增加，细菌性疾病在养殖过程中日益严重[1-3].温和气单胞菌是引起鱼类细菌性败血症重要致病菌之一，已在鲤鱼(Cyprinoid)[4]、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)[5]和黄鳝(Ricefield eel)[6]等水产动物中分离鉴定，产生了极大的危害.目前，对温和气单胞菌的研究主要集中在鉴定和治疗方面，但尚缺乏齐口裂腹鱼感染温和气单胞菌后血浆酶指标的相关报道[7-9].血浆中抗氧化酶活性与机体的健康和免疫力密切相关[10-11].总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶活性(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)等指标作为血浆中相关的抗氧化酶和氧化酶可消除机体内的自由基，保护细胞免受损伤.而黄嘌呤氧化酶(XOD)作为体内重要的核酸代谢酶之一，可加快自由基的产生.因此，为探讨鱼体在受到病原菌侵袭后免疫功能的变化，本试验对齐口裂腹鱼进行温和气单胞菌的人工回感试验并检测血浆中抗氧化指标的变化，以期为齐口裂腹鱼的疾病诊断和防控积累科学资料.

1 材料和方法

1.1 试验动物

健康齐口裂腹鱼购于四川某养殖场，体重400± 50 g，体长37±5 cm.

1.2 试验菌株

菌株WS6202分离自患病鲫鱼，经鉴定为温和气单胞菌，保存于本实验室-80℃超低温冰箱.

1.3 试验器材及试剂

抗凝剂(3.8%柠檬酸钠)、紫外分光光度计(TU-1901)、离心机(Eppendorf)、总抗氧化能力、总超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和黄嘌呤氧化酶试剂盒均购于南京建成生物工程研究所.

1.4 动物回感及血液采集

将40条健康齐口裂腹鱼随机分为正常组和感染组.正常饲养一周后进行实验，在饲养过程中，正常充氧.根据麦氏比浊法将保存菌株配制成浓度为2.0× 108cfu/mL的菌悬液，每条鱼注射菌液1.0 mL，对照组注射等量0.75%生理盐水.每天观察记录鱼体状况，在6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、90 h分别从对照组和实验组随机采样3条尾静脉抽血.剖解发病鱼体，无菌条件下分离细菌，进行再次鉴定.

1.5 血浆指标的测定

按照1∶9的比例将抗凝剂与抽取血液混合后室温下静止1 h，离心10 min(3500 r/min)，上样液体即为血浆.根据南京建成生物试剂盒说明书进行TSOD、T-AOC、XOD和CAT指标的测定.数据用SPSS 17.0软件进行分析，采用单方差因素进行差异显著性分析(P＜0.05或P＜0.01为显著差异).

2 结果

2.1 临床及剖解变化

齐口裂腹鱼经腹腔注射24 h后逐渐出现游动缓慢，胸鳍、腹鳍基部出血，眼球突出，腹部肿大，对照组未见异常变化.剖解可见，肝脏肿大，呈土黄色，脾脏肿大，肠道充盈剖开可见泡沫状液体.再次分离培养病原菌，经鉴定为温和气单胞菌，这可确认齐口裂腹鱼的发病由温和气单胞菌引起.

2.2 血浆指标的测定

齐口裂腹鱼在感染温和气单胞菌后，测定感染组中T-SOD、T-AOC和CAT指标均出现先上升后下降的变化趋势，但XOD活性在感染24 h后呈上升水平(表1)，这在一定程度上反映出齐口裂腹鱼机体的健康免疫状况.

表1 齐口裂腹鱼感染温和气单胞菌血浆指标的变化Table 1 Changes of serum indices of Schizothorax prenanti infected with Aeromomas sobria

2.2.1 总超氧化物歧化酶(T-SOD)

由图1可知，与对照组相比，感染组血浆中TSOD活力呈先升高再降低的变化趋势，在感染6 h和 12 h时T-SOD活力极显著性升高(P＜0.01)，但在24 h后又明显低于对照组，且差异极显著(P＜0.01).

图1 总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力测定结果Fig.1 The results of the activities of T-SOD

2.2.2 总抗氧化能力(T-AOC)

由图2可知，与对照组相比，感染6 h后T-AOC活力开始上升，24 h达到高峰出现极显著差异(P＜ 0.01).但在48 h后开始下降，且在90 h后低于正常水平.

图2 总抗氧化能力(T-AOC)测定结果Fig.2 The results of T-AOC

2.2.3 过氧化氢酶(CAT)

由图3可知，与对照组相比，感染6 h后CAT活力呈上升趋势，且在48 h出现极显著性升高(P＜0.01)，随后下降略低于正常水平.

2.2.4 黄嘌呤氧化酶(XOD)

由图4可知，与对照组相比，在感染12 h内XOD活力未见明显变化，但在24 h后随着感染时间的延长而升高，出现差异极显著(P＜0.01).

图3 过氧化氢酶(CAT)测定结果Fig.3 The results of the activities of CAT

图4 黄嘌呤氧化酶(XOD)测定结果Fig.4 The results of the activities of XOD

3 讨论

血浆学是研究鱼体生理生化理论基础的重要内容之一，血浆指标的测定可为鱼体健康状况、疾病诊断和免疫力的评价提供参考数据.肖玲远等[12]和陈永祥等[13]研究发现养殖型齐口裂腹鱼血浆中总蛋白含量、血糖等指标明显高于野生型齐口裂腹鱼.在齐口裂腹鱼饲料中添加适量的黄芪多糖或β-葡聚糖可明显改变机体血浆中酶活指标，不仅可提高齐口裂腹鱼的生长性能，且可提高免疫功能[14-15].这表明外界环境和其他条件的改变都可引起齐口裂腹鱼血浆学指标的改变，进一步影响鱼体的生长和免疫功能.

鱼体在受到病原菌侵袭后，会立刻激活非特异性免疫防御系统，清除外来异物，保护机体健康，但当鱼体出现发病或是死亡时机体免疫力显著下降.日本鳗鲡(Anguilla Anguilla)感染嗜水气单胞菌初期机体血浆中SOD活性指标出现显著性上升，但在后期出现下降[16].锯缘青蟹(Scylla serrata)在感染白斑综合症的濒死期SOD活力显著下降[17].南方大口鲶(Silurus meridionalis)在投喂温和气单胞菌灭活疫苗后血浆中抗体效价明显升高.在本研究中齐口裂腹鱼感染温和气单胞菌6 h后T-SOD、T-AOC和CAT活性均显著性升高，这可表明齐口裂腹鱼在感染初期时，温和气单胞菌可刺激鱼体激活免疫防御系统，提高鱼体免疫功能.但在齐口裂腹鱼感染48 h后活性指标均下降，且在90 h后低于对照组，这与卢卫红等研究结果略有差异，日本鳗鲡和大口黑鲈(Micropterus salmoides)感染温和气单胞菌后肝脏、肾脏、鳃等组织中SOD活性明显低于健康组，且发病死亡鱼体组织中的SOD活性与健康组相比极显著性下降[18-19].这些差异一方面可能是由于测定血浆的时间点不同所引起，另一方面可能是鱼的种类不同所致.

T-SOD、T-AOC和CAT作为机体重要的抗氧化酶可相互协作有效清除机体自由基，提高机体抵抗力，但当机体组织器官受到损伤时，黄嘌呤氧化酶可协助机体自由基的产生，加速鱼体的发病[21-22].刘伟成等研究随着镉胁迫时间的延长，大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)肝脏中XOD活性显著性升高[23].在本研究中，当齐口裂腹鱼感染温和气单胞菌24 h后XOD指标不断上升.这进一步表明温和气单胞菌感染齐口裂腹鱼后，随着病程的发展会在一定程度上损伤鱼体内脏器官，破坏细胞基本结构和功能，致使免疫能力下降.

综上所述，T-SOD、T-AOC、CAT和XOD等4个血浆指标的变化可作为判定齐口裂腹鱼健康状况和疾病诊断的参考指标.这也为水产细菌性疾病疫苗的研发和免疫防治奠定理论基础.

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(责任编辑:李建忠，付强，张阳，罗敏；英文编辑:周序林，郑玉才)

Changes of serum antioxidant enzymes in Schizothorax prenanti artificially infected with Aeromomas sobria

ZHAO Jing1，WANG Li2，ZHONG Hong-mei2
(1.Institute of Qinghai-Tibet Plateau，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.；2.School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

In order to discuss the effects of Aeromomas sobria on serum antioxidant enzymes in Schizothorax prenanti，health Schizothorax prenanti were artificially infected with Aeromomas sobria.The activities of total superoxide dismutase(T-SOD)，total antioxidant capacity(T-AOC)，xanthine oxidase(XOD)and catalase(CAT)were investigated at 6 time points.The results showed that the activities of T-SOD significantly increased at 12 h(P＜0.01)and then decreased after 24 h.The activities of TAOC increased and reached the highest level at 48 h(P＜0.01)，then quickly decreased.The activities of CAT initially increased and then decreased after 48 h.The activities of XOD continuously increased after 24 h(P＜0.01).These results suggested that the four serum indices tested could be important references of health and diagnosis of Schizothorax prenanti.

antioxidant enzyme；Aeromomas sobria；Schizothorax prenanti

S941.42；S943

A

2095-4271(2016)06-0621-05

10.11920/xnmdzk.2016.06.005

2016-06-22

王利(1977-)，女，汉族，成都人，副教授，博士.研究方向:动物医学.E-mail:qinxin916＠aliyun.com

四川省科技支撑项目(2016NZ0044)；西南民族大学研究生学位点建设项目(2016XWD-S071007)