核磁共振技术在大豆科学研究中的应用

程健博 李朋 孙悦 高帅 张根生

哈尔滨商业大学，黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076

核磁共振技术在大豆科学研究中的应用

程健博 李朋 孙悦 高帅 张根生

哈尔滨商业大学，黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076

核磁共振技术在大豆科学研究中的应用具有重要影响，本文从核磁共振技术在大豆蛋白研究中的应用，在大豆特定成分检测中的应用及在大豆油脂品质控制中的应用三个方面阐述了核磁共振技术对大豆科学相关研究的影响，并对核磁共振技术在大豆科学研究的探索方向进行了展望，为该技术的进一步推广应用提供借鉴和参考。

核磁共振技术; 大豆；应用

近年来，核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）技术在食品领域中的应用日益成熟，且在大豆科学研究中的应用也越来越得到重视。核磁共振波谱最早于二十世纪中叶由哈佛大学的伯塞尔((E.M.Purcell)和斯坦福大学的布洛赫(F.Bloch)等人用实验所证实。与质谱、红外光谱、紫外光谱共同称为有机分析四大谱的NMR波谱，在我国已有几十年的发展历史，由于其广泛的应用范围和严密的理论基础，并凭借快速、无损及操作简便的应用特点，已经成为一种不可多得的重要分析手段。

目前核磁共振技术在大豆科学研究中的应用主要集中在低场核磁共振（L-NMR）、氢谱高频核磁共振（1H-NMR）、碳谱高频核磁共振（13C-NMR）及磷谱高频核磁共振（31P-NMR）四个方面。在大豆蛋白质结构测定、特定成分定性检测和油脂品质控制等领域的应用均有明显的优势，但NMR技术在定量测定目标成分时，在准确性方面还存在偏差，综合评价体系还没有建立。本文主要介绍的是NMR技术在大豆科学研究中的应用进展。

1 NMR技术在大豆蛋白研究中的应用

1．1 大豆蛋白结构的表征

NMR测定蛋白质结构的表征方法主要包括四大基本要素：（1）结构测定的主要NMR参数NOE （nuclear overhauser effect）距离测定；（2）核磁谱峰序列专一性归属；（3）NMR结构计算及结构评价；（4）数据收集的多维NMR技术。华菁对聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸与大豆分离蛋白接枝进行了探究，将大豆分离蛋白分散在8mo1/L尿素水溶液中，在氮气保护下，以过硫酸铵为引发剂，合成了大豆分离蛋白接枝聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸共聚物（SPI-g-PAMPS），对以大豆分离蛋白为基质的层层组装进行了探讨。用13C固态核磁共振仪（13C -NMR）对SPI-g-PAMPS进行了表征，在δ=42、δ=53、δ=178处均有与SPI-g-PAMPS相吻合的吸收峰，证明了聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸己成功接枝到了大豆分离蛋白上。傅立叶红外光谱仪（FTIR）及电镜表征均证实聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸己成功接枝到了大豆分离蛋白上。Makoto Shimoyamada等在1H-NMR谱中，大豆α-乳清蛋白/皂素胰蛋白酶水解过程和α-乳清蛋白的结构变化进行表征。在探究大豆LEAI蛋白在不同环境中，保守基序Em-2M和Em-C多肽的结构及聚集行为时，薛蓉等选用TSP-d4作为内标，通过核磁共振波谱(NMR)法证实Em-C的螺旋和折叠结构特征及聚集行为可能在全长蛋白的功能中起到重要作用。

1．2 大豆蛋白特性的测定

在大豆科学领域，蛋白特性测定的准确性尤为重要。刘俊梅等在探究高剪切分散乳化技术促进凝胶持水性时，采用L-NMR技术从水分分布、水分迁移、持水能力三个方面研究高剪切分散乳化技术对大豆分离蛋白凝胶体系中水分状态影响机制。试验发现，横向弛豫时间T21、T22、T23与剪切力表现为极显著负相关，高剪切分散乳化技术能够提高TG酶诱导的大豆蛋白凝胶持水能力，在贮存过程中，高剪切分散乳化技术能显著提高凝胶持水性。Emmanuel Lepinel 等13C-NMR技术探究生物大豆粉中制备糠醛合成胶粘剂时，糠醛的反应与氢氧化钙用量相关，亚甲桥的建立通过康尼查罗反应完成。但是，并没有证明制备糠醛过程有共价离子的参与。相似研究还出现在孙超的文章中，大豆分离蛋白及其接枝产物两张谱图在化学位移δ=54和δ=173处都存在吸收峰，其应分别归属于大豆分离蛋白分子中的氨基酸上的叔碳和羰基碳的吸收峰，这与于德泉、杨峻山报道的化学位移吻合。而在接枝产物的谱图中新出现了四个吸收峰，化学位移分别δ=55、δ=16、δ=6和δ=184，它们分别归属于聚甲基丙烯酸接枝链上的仲碳、伯碳、季碳和梭基上的碳，这与谢缅诺维奇.赫拉莫娃[20]报道的c、d、e、f各自的化学位移值分别为δ=54、δ=17、δ=45和δ=179，也是吻合的。由此进一步证明了大豆分离蛋白接枝甲基丙烯酸的成功。

1．3 挤压大豆蛋白水分的表征

陈锋亮等在研究大豆蛋白挤压组织化过程中水分的变化时，选择L-NMR法中的CPMG脉冲序列测定，用横向弛豫时间T2进行表征。由于挤压组织大豆蛋白中水分含量较低，研究者将采样点数（TD=21150）、采样频率（SW=250.00kHz）、间隔时间（TR=600ms）、回波个数（Echo Count=350）、累加次数（NS=32）均设置为较高值以增加测试准确性。Ruan R. S等研究发现，水分子的流动性与驰豫时间的长短成正比例关系。弛豫时间越短，水分与底物结合越紧密，弛豫时间越长，水分越自由。因此，根据弛豫时间的长短，可以得知水分与物料的结合程度。差示量热扫描（DSC）和L-NMR两种方法分析挤压组织化产品中水分形态结果的相关分析，可以看出，DSC测得的冻结水、非冻结水分别与L-NMR法测得的自旋-自旋弛豫时间T22和T21之间存在显著的相关关系，相关系数分别为0.96（p＜0.01）和0.54（p＜0.05），这表明尽管DSC和L-NMR这两种技术的测定原理截然不同，但两种方法测定水分状态的结果是相同的，但低场核磁脉冲在测定速度、成像等方面具有明显优势。

2 NMR技术在大豆特定成分检测中的应用

2．1 大豆卵磷脂含量的测定

核磁共振波谱可用来作定量分析，其定量分析的基础是各化学环境不同的核、吸收峰出现的位置不同，可得到不同化学位移信号。施邑屏等采用了核磁共振法（31P-NMR）对针剂大豆卵磷脂的组份进行了定性及定量分析。与定磷法等经典磷脂分析方法相比，31P-NMR法分析磷脂化合物具有快速、灵敏、干扰因素较小，准确度较高的优点。不足之处是样品需要量较大，在90兆核磁共振仪中，一般需要30～60mg。类似的研究还出现在对磷脂酶A1催化水解大豆卵磷脂后的样品中，卵磷脂、溶血磷脂、甘油磷脂酰胆碱的相对含量的测定试验中。杜章斌等利用1H-NMR，分别选取化学位移δ=3.76～ 3.83、δ=4.14～4.16、δ=4.40～4. 50处的信号峰作为卵磷脂、溶血磷脂和甘油磷脂酰胆碱的特征性质子峰，并根据质子峰相对面积与物质的量的对应关系确定三者的含量。结果表明，卵磷脂、溶血磷脂、甘油磷脂酰胆碱的加标回收率分别为101.6%～107.0%、79.8%～92.4% 、102. 0%～107.1%，相对标准偏差分别为1.6%～2.5%、3. 6%～6.5%、5.6%～6.7%。精密度试验中卵磷脂、溶血磷脂、甘油磷脂酰胆碱的相对标准偏差分别为4.2% 、3.5% 、2.3%；对磷脂酶A1催化水解大豆卵磷脂4h与8h的两个样品进行检测，结果表明样品中卵磷脂、溶血磷脂、甘油磷脂酰胆碱的相对含量分别为71.2% 、22.1 %、6.7%、22.4%、0、77.6%。

郑卫琴等采用1H-NMR和31P-NMR两个图谱结合起来分析高纯大豆卵磷脂HLB值的方法，通过建立求算HLB值得方程式HLB=21.4R，可快速有效测定出非离子表面活性剂大豆卵磷脂不同PC纯度的HLB值，这对产业化制备高纯度卵磷脂有实质性意义，比HPLC法分析更快速，但在准确度上与HPLC法稍有差距。杨丽华等用31P-NMR法对磷脂中磷含量及卵磷脂含量进行测定。即用31P-NMR谱测定总磷含量，并以已知含磷量的三苯基膦为样品，验证该方法的可行性，误差在±5%。用31H-NMR谱测定了磷脂中卵磷脂含量，该方法简单便捷，结果反应迅速，可用于对大豆磷脂含量的快速检测。

2．2 大豆中油脂含量的测定

利用NMR技术快速无损测定成分含量，是一项国际前沿技术。马爱萍等利用索氏提取法、NMR法和NIRS法对大豆种子脂肪含量进行测量比较，结果表明NMR法测定的结果与索式提取法更接近，偏差均小于95%，最低偏差仅为2%，而NIRS法与索式提取法有较大偏差。宋丹阳等用NMR法建立大豆含油量核磁共振法测定标准曲线，并进行了大量样品数据分析（大豆含油量的分析）。NMR法测定与国家标准索氏抽提法测定结果的标准曲线为y=09632x+07937，相关系数为0 98%，与索氏抽提法相比，具有简便快速、安全、不损伤种子且不需烘干样品等优点。在大豆品种改良、收购及加工利用和进出口贸易等领域具有广阔的应用前景。

3 NMR技术在大豆油脂品质控制中的应用

3．1 大豆油品质的测定

煎炸食品的质量与煎炸油的品质关系巨大，油脂的酸价、碘价、极性组分含量、烟点、过氧化值、羰基价等指标都是反映其质量的重要指标。低频核磁共振（L-NMR）技术作为一种快速、准确、无损的检测方法，可广泛用于油品质的监测过程。张瑜等[30]通过核磁共振弛豫时间T2w与煎炸时间、酸价、拨基价、极性组分含量的相关性发现，两者呈负相关性，相关系数在0.9058～0.994之间。Justyna Sadowska等同样对大豆油的氧化影响进行了研究。经1H-NMR及13 C-NMR分析，氧化时间影响大豆油酸价，粘度和摩尔质量。王永巍等同样应用L-NMR技术对煎炸大豆油油样进行检测，通过对T2、T2w及S21分析，煎炸4h后图谱中10ms左右出现特征峰，峰值较小，且S21和T2w与煎炸时间、酸价、粘度、吸光度和极性组分含量呈明显的规律性，相关系数在0.941 ～0.997之间。 分析煎炸过程中，氧化、聚合、水解等反应可能产生了不同于甘油三酷的物质，导致理化指标改变，进而引起油脂内部磁场的改变，氢质子从磁场的激发态到平静状态的恢复时间发生了变化。

Maritana Fariasa等在基于氧化钼（VI）络合物运用均相催化系统研究大豆油环氧化问题时，在800℃条件下，反应产物反应8小时后，形成单环氧化物的产品可以从1H-NMR谱中，2.9 ppm处出现有关形成环氧基团中的氢信号得到验证。张钟华等基于核磁共振原理，研制的一种大豆含油量快速测定仪，与传统检测大豆含油量过程复杂、耗时长、准确性不够高的萃取方法相比，该设备可快速得到大豆含油量读数。且测量范围为10%～25%，读数精确度大于99%。以上研究说明L-NMR技术可有效地反映大豆煎炸油品质的改变。杨扬等利用1H-NMR，13C-NMR光谱（核磁共振氢谱、碳谱）检测了大豆油及地沟油进行检测。结果发现，地沟油在氢谱图的δ5.50、δ5.10和δ3.73等处有明显的杂峰；地沟油在氢谱图的δ1.26处的峰比δ1.30处明显强很多；地沟油碳谱图在δ178.33，δ173.87，δ86.60，δ68. 39和δ65. 06处有明显的小峰存在，这是由于其产生酸败和处理过程中有部分甘油酯的分子发生变化造成的。所以该方法可以作为判断地沟油的依据。

3．2 大豆生物柴油品质的测定

Isac G. Rosset等在用南极洲念珠菌固定化脂肪酶催化酶解大豆油时，利用1H-NMR技术和气相色谱对生成生物柴油过程进行定量分析。在1H-NMR谱中，明显发现南极念珠菌B型固定化脂肪酶催化大豆油的条件更温且得率高。1H-NMR技术和气相色谱均可对其进行表征，但1H-NMR技术更加简便。M.R. Monteiro等使用1H-NMR定量描述大豆油制备生物柴油过程，采用核磁共振和积分运算分析油脂结构并绘制标准曲线。结果表明，1H-NMR法可以不受任何生物柴油或柴油类型的影响，因此，这种技术是特别有价值的测定方法。

4 结语

自从二十世纪中叶以来，就有关于NMR技术在大豆科学研究中应用的报道出现，但大多数是研究NMR技术的表层机理。建立NMR技术在大豆蛋研究，大豆特定成分检测及在大豆油脂品质控制等领域的综合评价体系，是未来探索的重要方向之一。这类体系的建立，不仅可以更广泛的准确定量检测目标成分，同时也可以更加快速便捷的获得试验结果，这将对 NMR技术在大豆科学研究中的应用有极为重要的意义。

[1]高明珠．核磁共振技术及其应用进展[J]．信息记录材料,2011(03): 48-51．

[2]黄友如,裘爱泳,华欲飞．核磁共振技术在大豆蛋白研究中应用[J]．粮食与油脂,2004(02): 19-21．

哈尔滨商业大学创业训练项目 201510240162

程健博(1991—)，男，硕士，研究方向为食品科学．

⋆通讯作者：张根生(1964—)，男，教授，硕士，研究方向为畜产品加工。