分子标记技术在人参种质资源研究中的应用与展望

侯志芳，雷秀娟，张艳敬，梁韶，王英平，郑培和

(中国农业科学院特产研究所，长春130112)

人参(PanaxginsengC.A Meyer)属五加科人参属多年生宿根草本药用植物，是闻名遐迩的“东北三宝”之一。在中国，人参历来被视为百草之王。人参种质资源是人参生产的源头，是人参育种的原始材料，是人参产业发展的基础。人参种质资源的好坏直接决定了人参质量的优劣和产量的高低，因此，人参种质资源的收集和保存至关重要。新形势下，种质资源圃是植物的主要保存方式，是植物种质保存的主要场所[1]。种质资源的鉴定也是种质资源必不可少的内容，分子标记技术具有高效、快速等优点，有效弥补了多年生植物生长周期长、繁殖难这一缺点，所以分子标记技术可以作为人参种质资源分析和鉴定的一种有效方法。

分子标记通常指在生物个体或群体之间可遗传并可检测的具有差异的DNA序列，发展迅速，渗入到生物学科的各个领域，自20世纪80年代，AFLP作为研究生物遗传多样性的方法以来[2]，分子标记技术备受研究者青睐。本文对近些年在人参种质资源研究中应用比较多的随机扩增多态性(Random amplified polymorphic，RAPD)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)、简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)、简单重复间序列(Inter-simple sequence repeat，ISSR)、相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)、单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)等6种分子标记进行总结和讨论，为人参的深入研究提供理论基础。

1　人参种质资源的研究现状

野生人参和栽培人参是人参种质资源中最主要的两大类型，其中野生人参为国家珍稀濒危物种。近年来，由于人们保护不当，人参种质资源遭到严重破坏，栽培人参品质下降、品种混乱，野生人参资源更是呈减少趋势。因此，收集和整理人参种质资源迫在眉睫，急需构建人参种质基因库[3]。人参栽培历史悠久，经过不断选择和长期进化，栽培人参已形成长脖参、石柱参、边条参、大马牙、园膀园芦、二马牙等不同的品种类型[4]，但这些大部分只是根据形态特征和栽培特点所命名，并没有规范明确的命名依据。人参特有的生长条件和较长的生活周期等外界因素制约了其农艺性状特征的一致性，因此，在异地栽培条件下根据其农艺性状进行准确识别的难度也较大[5]，所以，仅仅靠形态学标记不能满足对人参种质资源的收集、鉴别、保护和利用。

2　分子标记技术在人参种质资源研究中的应用

2.1　RAPD分子标记

RAPD分子标记是Williams[6]和Welsh[7]于1990年首次报道的一种较为简便的检测DNA多态性技术，该技术具有简便、快捷的优点，初期深受研究者喜爱。1997年，冯斗等[8]应用RAPD方法首次获得了人参的DNA特异性扩增片段，对不同人参品种进行了鉴定，结果显示了2种人参品种的特异性条带，证实了RAPD方法应用于人参鉴定是可行的。周桐[9]和许永华[10]分别优化了人参基因组DNA的提取方法和RAPD-PCR反应条件。结果表明，用改良的CTAB方法提取的DNA均达到了RAPD-PCR分析的要求。Erin M.Schlag等[11]使用RAPD标记研究了西洋参品种间的遗传多样性。但由于RAPD标记重复性差、扩增条带有限等缺点，近年来逐步被其他分子标记技术所取代。

2.2　AFLP分子标记

1993年，荷兰Keygene公司的Zabeau和Vos 2位科学家提出了一种通过对基因组DNA进行高通量分析的分子标记技术[12]，即AFLP技术。该技术不仅能完成基因组DNA的高通量分析，而且还可以对全基因组多个遗传变异位点进行分析[13]，在基因流动和遗传变异等方面被广泛应用[14]。2000年，马小军等[15]应用AFLP技术研究了5个农家类型人参DNA，从其特定指纹中发现长脖人参更接近野生人参，长脖人参内部有更多的杂合态个体，因此，长脖人参的AFLP有相对较高的多态性。但由于该分子标记受多因素影响且有操作复杂、反应步骤多等缺点，很难得到理想的结果，导致该技术在实验室中应用较少，在人参研究中更是鲜有报道。

2.3　SSR分子标记

SSR也称作微卫星DNA，是基因组中的1～6个核苷酸组成的基本单位多次重复形成的一段DNA，基于此而开发了SSR分子标记技术[16]。SSR标记根据两端相对保守的单拷贝序列设计特异性引物，然后对重复区域进行PCR扩增，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增片段的多态性。Hong-Il Choi等[17]应用EST-SSR标记评估了人参品种及其相关物种间的遗传多样性，平均每对引物可扩增1～4条带，表明人参具有高度重复的多倍体基因组序列。Nam-Hoon Kim等[18]使用EST-SSR开发了19个微卫星标记，建立了9个韩国品种的认证系统，并分析了这些品种间的系统发育关系，认为该分子标记将应用于人参种子产业。由于SSR标记是共显性遗传，具有较高的多态性，且有技术操作简单、重复性好和特异性强等优点，现在人参研究中应用较为广泛。

2.4　ISSR分子标记

1994年，加拿大Zietkiewicz等[19]提出了一种不需构建繁琐的基因文库、随机选取重复序列和锚定碱基，利用PCR扩增进行检测的分子标记技术，即ISSR分子标记。ISSR标记无需知道任何靶标序列的SSR背景信息，同时具有DNA用量少、重复性好、操作简便且DNA多态性高等优点[20]。但ISSR为显性遗传标记，不能区分显性纯合基因型和杂合基因型，目前在人参种质资源研究中鲜有报道。

2.5　SRAP分子标记

2001年，Li博士和Qu-iros博士[21]创立了另外一种不需预知物种基因序列，直接利用PCR扩增进行检测的分子标记技术，即SRAP分子标记。因其具有多态性丰富、简单、结果稳定、高效、高共显性、易测序且不需预知物种基因序列信息等优点，已逐步被国内、外学者应用于苹果[22]、马铃薯[23]等果蔬的研究中。许永华[24]、宋佳等[25]对竹节参SRAP-PCR引物退火温度和扩增体系的dNTPs、Taq DNA聚合酶浓度、DNA模板、引物等条件进行摸索，构建并优化了适合竹节参DNA的SRAP-PCR扩增体系。SRAP技术在人参中的研究鲜有报道，但许永华等基于人参SRAP反应体系的研究成果为SRAP技术应用于人参品种的鉴定奠定了基础。

2.6　SNP分子标记

SNP是指染色体基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A，G，C，T)突变引起的多态性，变异形式多种多样，主要有插入、缺失、转换和颠换等。SNP具有较高的遗传稳定性，是基因组中最常见、最简单的多态性形式，因此，在生物学、医学、农学等多领域被广泛应用。与其它分子标记相比，SNP分子标记分布广泛、遗传稳定、易于基因分型，非常适用于种间的快速鉴定。

崔光红等[26]利用SNP对人参、西洋参药材进行了鉴别，主要从特异等位基因的发现、PCR反应体系、引物设计等方面全面证实了SNP在药材鉴别中的可行性。王洪涛等[27]分别基于线粒体cox2[28]、nad7[29]以及26srDNA[30]部位的SNP位点鉴定了韩国品种“Chunpoong”，同时，还基于线粒体nad7部位的SNP位点鉴定了韩国品种“Gumpoong”和“Chungsun”。Juyeon Jung等[31]通过单核苷酸的差异，开发了可靠、方便的叶绿体DNA标记来鉴别韩国人参和西洋参产品。Xiaochen Chen等[32]基于DNA条形码快速鉴定和分析了人参属人参、西洋参和三七。由于其简单、稳定等优点，SNP深受研究者的喜爱，现在在人参品种间的快速鉴定中应用较为广泛，尤其是在韩国，有很多学者已经应用SNP标记对人参进行了深入研究。

3　问题与展望

分子标记辅助育种[33]是当今作物育种的发展方向，由于人参生长周期长且形态标记(如根形、果色)数量有限，而分子标记不受时间和组织器官的限制，可缩短育种周期，用于当年选择，因此，对人参选种育种大有裨益。将来的研究，还应充分应用分子标记技术加大对人参重要农艺性状相关的人参抗逆性、抗病虫害、丰产、皂苷合成等特殊基因及主要功能基因的挖掘和利用，同时，与其他大田作物相结合[34]，加快在分子辅助育种上的应用进程。科学家们已经取得了人参cDNA文库[35]、叶绿体基因组[36]、EST文库[37]等一些标志性成果，与此同时，人参在分子生物学领域的研究将走向新的高度、开启新的篇章。可以预见，在不久的将来，人参分子生物学研究的热点也将转向人参基因组学、转录组学及蛋白组学等各种组学。相信在不久的将来随着核酸序列数据库等资源的公共化和各组学的深入研究，人参全基因组测序也必将被公布。并且，cDNA-AFLP[38，39]、cDNA-SRAP[40]和EST-SSR[41]等新型分子标记技术的应用必将极大推动人参等五加科植物各方面的研究，有利于我们开发出更为直接有效的分子标记技术。同时，借助生物信息学等手段开展与西洋参、竹节参、三七等近缘种核酸序列数据库等资源的比对，获取、定位大量影响重要农艺性状的功能基因，加快人参分子标记辅助育种的发展速度，为人参优良品种选育和种质资源保存提供更加有力的支持。

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