能源贮备与繁殖：Leptin影响GnRH神经元可能的信号通路

薛海龙，宋兴超，曹新燕，杨镒锋，陈秀敏，许保增，常彤，高兵

(中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室，长春130112)

哺乳动物的生命活动需要消耗大量的能量，必要的能源贮备数量是一切生命活动的基础。瘦素(Leptin，Lep)是脂肪分泌的外周激素，其含量与体脂含量成正比[1]，所以被称为反映外周能源贮备情况的信号物质。其动态变化是中枢神经内分泌系统调节能量平衡和生理活动的重要依据。Lep通过与主要分布于脑内瘦素受体(Leptin receptor，LepR)结合发挥作用。LepR属于细胞因子受体家族，至少有5种不同的形式[1]。

必要的能源贮备也是哺乳动物青春期启动和维持繁殖活动的必要条件，Lep作为重要的能源储备信号起到关键作用。缺乏Lep或LepR的人和小鼠无法进入青春期、不能生育，恢复这些个体的Lep水平，能恢复促黄体素(Luteinizing hormone，LH)峰，促进性成熟；缺乏Lep及LepR的成年动物LH分泌受到明显抑制并表现为不孕不育，外源Lep能逆转短期禁食引发的男性促性腺激素和雄激素水平下降。Lep缺乏还能引发雄性繁殖缺陷。早期认为，Lep能诱导雌性青春期的启动[2，3]。后期研究表明，Lep不能独自启动青春期，是启动青春期的必要不充分条件[4，5]。

Lep水平对繁殖活动的上述影响实质是中枢繁殖系统对能源储备信号做出的反应，这种反应除了能源储备数量(Lep水平)外，还与中枢系统对Lep的敏感性有关，这种敏感性与能源储备的需求有关。一般而言，机体对能源储备需求越高，对Lep的敏感性越低，以便保持较高的能源储备。例如对能源储备需求较高的女性青春期循环系统中的Lep水平升高[5]；而对能源储备需求相对较低的男性青春期循环系统中的Lep水平未出现升高[6，7]。动物妊娠期对能源储备需求较高，此时中枢系统对瘦素的敏感性下降，机体会允许较高Lep水平和脂肪储备数量；病理性肥胖(可以理解为对能源储备需求过高的病理状态)的男性具有高Lep水平，而雄激素水平反而下降，性腺机能减退[8]。

哺乳动物的繁殖活动主要受下丘脑-垂体-性腺轴调控。位于下丘脑视前区的促性腺释放激素神经元释放促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)，诱导垂体释放促性腺激素，促性腺激素刺激性腺激素的分泌，三者共同协作调节繁殖活动。Lep主要通过影响GnRH神经元活动，进而影响下丘脑-垂体-性腺繁殖轴调节繁殖活动。但是，GnRH神经元不表达功能性LepR，敲除所有神经元上的LepR导致青春期阻滞和不育；选择性敲除GnRH神经元上的LepR并未影响雌鼠的青春期启动和生殖功能[9]。因此，Lep并非直接调节GnRH神经元的活动，而是通过复杂的中间途径间接调节GnRH神经元的活动。最新研究表明，脑内的某些中间神经元是这些中间途径的重要组成部分。这些中间神经元一般具备两个特点：①位于脑内，存在LepR，能与Lep结合；②与Lep结合后能调节GnRH神经元神经内分泌系统活动。本文试图从这些中枢中间神经元切入，从能源储备与繁殖关系的角度，探讨外周的能源储备信号(Lep)调节中枢的GnRH神经元的作用途径，试图进一步揭示外周能源储备信号与中枢繁殖内分泌系统的关系。

1　Kiss1表达神经元

1.1　Kiss1表达神经元与GnRH神经元

下丘脑Kiss1表达神经元分泌神经肽Kisspeptins。Kisspeptins由Kiss1基因产物裂解产生，长度为13个～54个氨基酸，受体为G蛋白耦联受体54(G Protein-Coupled Receptors54，GPR54)[10]。Kiss1突变能引发原发性性腺机能亢进或不足[10]。Kisspeptin受体缺失鼠都具有不孕不育表型[10]。总之，Kiss1表达神经元对繁殖活动具有重要影响。Kiss1对繁殖活动的影响是通过调节GnRH分泌实现的，依据是使用拮抗剂阻断GnRH分泌后，Kisspeptin对繁殖活动的促进作用消失[11]；Kisspeptin神经纤维末梢连接或紧密毗邻GnRH神经元[12]；GnRH神经元中存在Kisspeptin受体GPR54[13]；Kisspeptin刺激GnRH释放并进入绵羊门脉循环[14]；Kisspeptin在体内体外均能激活GnRH神经元[15]。

1.2　Kiss1表达神经元与Lep

Lep直接影响Kiss1表达神经元的Kiss1表达，原因是小鼠和绵羊弓状核(arcuate nucleus，ARC)内的Kiss1神经元内检测到功能性LepR的mRNA[16，17]；低Lep水平与Kiss1mRNA的低表达相伴出现，这在ARC中尤其明显[16，17]；外源Lep能提高Lep缺乏动物下丘脑内Kiss1基因的表达[18，19]；Lep能提高能源储备不足的绵羊下丘脑ARC Kiss1 mRNA的表达，Lep能提高鼠科动物和人类神经细胞内Kiss1 mRNA水平[20]；Lep能直接激活几内亚猪ARC内Kisspeptin神经元[21]。

2　GABA神经元

2.1　GABA神经元与GnRH神经元

伽玛氨基丁酸(Gamma Aminobutyric Acid，GABA)是一种脑内广泛分布的抑制性神经递质，GABA神经元通过抑制GnRH 神经元上游活动，调节GnRH神经元活动和繁殖活动[22]。遗传性敲除GABA神经元上LepR后，雌鼠ARC和下丘脑视前区的前腹室周核(anteroventral periventricular，AVPV)内Kiss1 mRNA的表达量减少，而Kisspeptin是连接Lep与GnRH 神经元的重要信使[23]。因此GABA神经元至少部分通过影响Kisspeptin神经元活动调节GnRH神经元活动。

2.2　GABA神经元与Lep

GABA神经元表达LepR，敲除后，雌鼠表现为促性腺激素分泌不足、卵巢幼稚、卵巢衰竭、停止排卵、阴道开张延迟或消失、持续性不发情、生殖道萎缩和黄体缺乏。中枢性Lep信号缺乏所引发中枢性促性腺激素分泌不足，进而导致出生后卵巢发育不良，无法进入青春期等繁殖障碍[24]，与GABA信号缺乏的雌鼠表型一致，因此，GABA神经元可能是Lep信号调节繁殖活动的重要中间神经元。Lep可能通过与LepR结合减少GABA神经元的抑制作用调节繁殖活动。

3　nNOS神经元

3.1　nNOS神经元与GnRH神经元

一氧化氮(nitric oxide，NO)是一种重要的神经递质，在繁殖活动的神经内分泌调控中具有重要意义，能直接调节GnRH神经元的活性[25]。NO产生于视前区的神经性一氧化氮合成酶(neuronal NO synthase，nNOS)神经元，后者参与排卵控制[26]。下丘脑视前区是基底前脑表达nNOS的重要位点，在这里NO的释放会刺激GnRH分泌和排卵前GnRH/LH峰的出现[26]。nNOS缺陷雌鼠会出现排卵不规律、排卵前LH分泌减少、性腺机能减退等一系列繁殖障碍。Lep能恢复GnRH神经元下游的LH水平，而抑制nNOS活性后，神经内分泌繁殖轴无法感知Lep水平的升高，Lep对LH水平恢复影响消失，外源Lep也无法恢复Lep缺陷鼠的生育能力[26]。敲除或抑制nNOS后，Lep对GnRH/LH分泌的刺激作用减弱。

3.2　nNOS神经元与Lep

nNOS神经元也表达GPR54[26]，所以可能与Kisspeptin神经元存在功能上的互作。但是敲除Kisspeptin神经元上的LepR并未影响生育[27]，激活Kisspeptin神经元上的LepR未能促进性成熟。完全缺乏Kisspeptin/GPR54信号的情况下，Lep对LH的刺激作用并未减弱。因此，Lep对繁殖轴的刺激作用似乎不太依赖GPR54信号，而更依赖nNOS神经元，视前区的nNOS神经元是整合Lep信号与繁殖轴的重要神经元。

Lep能促进视前区(Preoptic area，POA)nNOS蛋白催化亚基的快速磷酸化，进而刺激GnRH神经元下游的LH分泌[26]。遗传性敲除或药理抑制nNOS蛋白，Lep对GnRH下游的LH刺激释放作用消失。一氧化氮合成酶1(Neuronal NO synthase1，NOS1)基因无效突变的Lep缺陷鼠，在长期的Lep作用下，依然无法完成性成熟。视前区的LepR表达对控制GnRH/LH分泌具有重要作用。总之，NO信号是连接Lep信号与繁殖轴的重要中介，POA是整合Lep与GnRH神经网络的重要位点。

下丘脑腹侧乳头前核(Premammilary ventral nucleus，PMv)腹部是Lep敏感区之一，参与生殖的神经内分泌调节[27]，这里多数表达nNOS的神经元能感知Lep的变化。PMv对Lep敏感的神经元是表达谷氨酸能(Glutamatergic，glu)神经元并与POA相连[27]。多数POA的nNOS神经元表达青春期启动相关受体，调节nNOS活性[24]，PMv内的glu神经元通过与POA内的nNOS神经元形态和功能上的互作调节GnRH神经元活动。谷氨酸能神经元与视前区nNOS神经元可能共同协作感知Lep变化调节GnRH释放。

4　结语

哺乳动物的能源贮备对繁殖活动具有重要意义。Lep是反映外周能源贮备数量的信号物质，是中枢神经内分泌系统调节能量储存与释放和繁殖活动的重要依据。动物的繁殖活动主要受下丘脑-垂体-性腺轴调控。Lep通过某些脑内中间神经元间接调节GnRH神经元活动，对动物的繁殖产生影响。Kisspeptin神经元、nNOS神经元和GABA神经元可能是连接Lep信号与GnRH神经元的重要中间神经元。这些中间神经元构成了连接Lep信号与GnRH繁殖神经内分泌系统途径的重要枢纽。探索连接Lep信号与GnRH神经元之间的信号通路，对在分子和细胞水平上揭示能源贮备与繁殖关系的本质具有重要的理论和实践意义。

[1]Jeffrey M.Friedman,M.D,Ph.D..The Function of Leptin in Nutrition,Weight,and Physiology[J].Nutrition Reviews,2002,60:1-13.

[2]Ahima RS,Dushay J,Flier SN,et al.Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice[J].Clin Invest,1997,99:391-395.

[3]Chehab FF,Mounzih K,Lu R,et al.Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin[J].Science,1997,275:88-90.

[4]Cheung CC,Thornton JE,Kuijper JL,et al.Leptin is a metabolic gate for the onset of puberty in the female rat[J].Endocrinology,1997,138:855-858.

[5]Roa J,Garcia-Galiano D,Castellano JM,et al.Metabolic control of puberty onset:new players,new mechanisms[J].Mol Cell Endocrinol,2010,324:87-94.

[6]Barash IA,Cheung CC,Weigle DS,et al.Leptin is a metabolic signal to the reproductive system[J].Endocrinology,1996,137:3144-3147.

[7]Castellano JM,Roa J,Luque RM,et al.KiSS-1/kisspeptins and the metabolic control of reproduction:physiologic roles and putative physiopathological implications[J].Peptides,2009,30:139-145.

[8]Caprio M,Fabbrini E,Isidori AM,et al.Leptin in reproduction[J].Trends Endocrinol Metab,2001,(12):65-72.

[9]QuennellJH,MulliganAC,TupsA,et al.Leptin indirectly regulates gonadotropin-releasing hormone neuronal function[J].Endocrinology,2009,150:2805-2812.

[10]Smith JT.Kisspeptin and energy balance in reproduction[J].Reproduction,2014,147(3):53-63.

[11]Shahab M,Mastronardi C,Seminara SB.Increased hypothalamic GPR54 signaling:a potential mechanism for initiation of puberty in primates[J].Proc Natl Acad Sci USA,102:2129-2134.

[12]Franceschini I,Lomet D,Cateau M,et al.Kisspeptin immunoreactive cells of the ovine preoptic area and arcuate nucleus co-express estrogen receptor alepha[J].Neuroscience Letters,2006,401(3):225-230.

[13]Han S K,Gottsch M L,Lee K J,et al.Activation of gonadotropin-releasing hormone neurons by kisspeptin as a neuroendocrine switch for the onset of puberty[J].Neuroscience,2005,25(49):11349-11356.

[14]True C,Kirigiti MA,Kievit P,et al.Leptin is not the critical signal for kisspeptin or luteinising hormone restoration during exit from negative energy balance[J].Neuroendocrinol,2011,23:1099-1112.

[15]Pielecka-Fortuna J,Chu Z & Moenter SM.Kisspeptin acts directly and indirectly to increase gonadotropin-releasing hormone neuron activity and its effects are modulated by estradiol[J].Endocrinology,2008,149:1979-1986.

[16]Smith JT,Acohido BV,Clifton DK,et al.KiSS-1 neurones are direct targets for leptin in the ob/ob mouse[J].Neuroendocrinol,2006,18:298-303.

[17]Backholer K,Smith JT,Rao A,et al.Kisspeptin cells in the ewe brain respond to leptin and communicate with neuropeptide Y and proopiomelanocortin cells[J].Endocrinology,2010,151:2233-2243.

[18]Luque RM,Kineman RD,Tena-Sempere M,et al.Regulation of Hypothalamic Expression of KiSS-1 and GPR54 Genes by Metabolic Factors:Analyses Using Mouse Models and a CellLine[J].Endocrinology,2007,148:4601-4611.

[19]Castellano JM,Navarro VM,Fernandez-Fernandez R,et al.Expression of hypothalamic KiSS-1 system and rescue of defective gonadotropic responses by kisspeptin in streptozotocin-induced diabetic male rats[J].Diabetes,2006,55:2602-2610.

[20]Morelli A,Marini M,Mancina R,et al.Sex steroids and leptin regulate the“first Kiss”(KiSS1/G-protein-coupled receptor 54 system) in human gonadotropin-releasing-hormone-secreting neuroblasts[J].Sex Med,2008,(5):1097-1113.

[21]Qiu J,Fang Y,Bosch MA,et al.Guinea pig kisspeptin neurons are deplarized by leptin via activation of TRPC channels[J].Endocrinology,2011,152:1503-1514.

[22]Zuure WA,Roberts AL,Quennell JH,et al.Leptin signaling in GABA neurons,but not glutamate neurons,is required for reproductive function[J].Neurosci,2013,33:17874-17883.

[23]PinillaL,AguilarE,DieguezC,et al.Kisspeptins and reproduction:physio logical roles and regulatory mechanisms[J].Physiol Rev,2012,92:1235-1316.

[24]Nicole Bellefontaine.Leptin-dependent neuronal NO signaling in the preoptic hypothalamus facilitates reproduction[J].Clin Invest,2014,124(6):2550-2559.

[25]Clasadonte J,Poulain P,Beauvillain JC,et al.Activation of neuronal nitric oxide release inhibits spontaneous firing in adult gonadotropin-releasing hormone neurons:a possible local synchronizing signal[J].Endocrinology,2008,149(2):587-596.

[26]Hanchate NK.Kisspeptin-GPR54 signaling in mouse NO-synthesizing neurons participates in the hypothalamic control of ovulation[J].Neurosci,2012,32(3):932-945.

[27]Donato J.Leptin’s effect on puberty in mice is relayed by the ventral premammillary nucleus and does not require signaling in Kiss1 neurons[J].Clin Invest,2011,121(1):355-368.