乌司他丁对急性脑出血模型兔sTM、vWF及脑组织病理的影响

佟丽妍史秀丽徐焕凤冯为民

乌司他丁对急性脑出血模型兔sTM、vWF及脑组织病理的影响

佟丽妍1史秀丽2徐焕凤3冯为民1

目的通过对急性脑出血模型兔动脉血可溶性血栓调节蛋白（sTM）、血管性假性血友病因子（vWF）以及脑组织标本病理变化的观察，探讨乌司他丁（UTI）在急性脑出血中的脑保护作用。方法 将造模后的30只兔随机分为脑出血组、依达拉奉组、乌司他丁组，每组10只。应用ELISA法测定各组兔急性脑出血后动脉血sTM、vWF的含量，以及兔脑出血病灶周围脑组织病理变化。结果与脑出血组 [sTM 24h：（6.06±0.19）ng/mL，72h：（6.42±0.48）ng/mL；vWF 24h：（10.02±0.71）ng/ mL，72h：（11.39±0.63）ng/mL]比较，依达拉奉组sTM含量[24h：（4.61±0.11）ng/mL，72h：（4.51±0.10）ng/mL]均有下降，差异有统计学意义（孕＜0.05）；依达拉奉组vWF含量在72h[（9.64±0.56）ng/mL]时下降，差异有统计学意义（孕＜0.05）；乌司他丁组sTM、vWF含量[24h：sTM（4.82±0.77）ng/mL，vWF （9.09±0.24）ng/mL；72h：sTM（4.79±0.75）ng/mL，vWF（8.48±0.73）ng/mL]均下降，差异有统计学意义（孕＜0.05）。依达拉奉组与乌司他丁组比较，24h、72h sTM含量差异均无统计学意义（孕＞0.05），24h及72h vWF含量比较差异均有统计学意义（孕＜0.05）。病理结果提示，乌司他丁组脑出血病灶周围脑细胞的线粒体嵴断裂，胞浆内空泡增多，细胞肿胀方面均比依达拉奉组延缓。结论乌司他丁可以降低急性脑出血模型兔血清sTM及vWF含量，以及出血灶周围脑细胞线粒体及细胞核的损害，具有一定的脑保护作用。

兔；急性脑出血；乌司他丁；可溶性血栓调节蛋白；血管性假性血友病因子

脑出血发病率为每年（60～80）/10万，在我国约占全部脑卒中的20%～30%，其急性期死亡率为30%～40%[1]。临床上脑出血后72h以内病情变化最剧烈。急性期是导致脑组织损伤最严重的时期，出血灶周围脑组织将发生一系列神经细胞损害变化，可出现脑细胞线粒体破坏，神经细胞凋亡等，最终导致神经功能损伤。乌司他丁（ulinastatin，UTI）是一种具有抑制多种酶、稳定细胞膜和溶酶体膜，抑制溶酶体酶的活性及释放作用的蛋白酶。研究[2]表明，UTI对脑梗死具有多方面脑保护作用，并在多项实验中证明有降低可溶性血栓调节蛋白（soluble Thrombomodulin，sTM）、血管性假性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）的作用，而后两者是目前被广泛作为反映内皮细胞受损的重要标志物。本实验旨在探讨UTI在急性脑出血后降低sTM、vWF方面的脑保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用健康成年新西兰兔，雌雄不限，体质量（3.0±0.2）kg，由浙江省农业科学院提供，许可证号:SCXK（浙）2010-0047。饲养期间给予啮齿类动物标准颗粒饲料及饮水，自主进食。温度（23±10）℃，湿度50%～70%，正常昼夜节律，噪音＜50dB，通风，单笼饲养。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.2 药品及试剂 乌司他丁注射液（规格:10万单位/2mL，批号:031301064）产自广东天普生化医药股份有限公司。兔sTM酶联免疫检测试剂盒（R&D公司，批号:Ra00281L）及兔vWF酶联免疫检测试剂盒（R&D公司，批号:Ra82321L）均购买自杭州达文生物有限公司。依达拉奉注射液产自南京先声东元制药有限公司（规格:10mg/5mL，批准文号:国药准字H20031342）

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型的建立与分组 参照文献[3]方法，并经改良后建立动物模型:将符合实验标准的新西兰兔，以自体血注入法制作脑出血模型:戊巴比妥钠（30mg/kg）耳缘静脉麻醉，头部剃毛，俯卧位固定于兔脑立体定位仪上。手术暴露颅骨十字缝和人字缝。参照Sawyer兔脑立体定位图谱[4]确定内囊位置: AP1mm，R6mm，H13mm。选取十字缝交叉点为基点沿冠状缝向右旁开6mm再平行矢状缝向前1mm为穿刺进针点。在兔耳中央动脉采取自体未凝动脉血0.5mL，用9号腰穿针快速垂直于颅骨穿入脑实质，进针深度13mm，3min之内缓慢注入，停针5min后缓慢拔针。局部压迫止血，缝合皮肤，造模完成。将造模后的30只新西兰兔按照随机数字表的方法，平均分为脑出血组、依达拉奉组、乌司他丁组三组，每组10只。

1.3.2 给药方案 脑出血组，予生理盐水2mL，乌司他丁组予UTI注射液1.7万U/kg（相当于成人用药量3倍剂量）加生理盐水稀释为2mL，依达拉奉组予依达拉奉注射液3mg/kg（相当于成人用药量3倍剂量）加生理盐水稀释为2mL，造模后连续3天静脉推注，1天3次。

1.3.3 标本采集及检测指标 于造模前（0h），造模后24h、72h，各组动物分别采集动脉血，离心后收集血清，严格按照试剂盒说明书采用ELISA法检测血清sTM、vWF的含量。于脑出血组造模后24h，乌司他丁组和依达拉奉组治疗后24h和72h，每组各取2只动物，开颅取脑，选取血肿周围组织约2mm×2mm固定于2.5%戊二醛中，送电镜标本制作及观察。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行统计分析，数据用（±s） 表示，采用单因素方差分析及t检验法，以孕＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组模型兔sTM及vWF变化 造模后各组sTM、vWF均上升。与脑出血组相比，依达拉奉组24h vWF含量差异无统计学意义（孕＞0.05），其余各组各时间点sTM及vWF均下降，差异有统计学意义（孕＜0.05）；依达拉奉组与乌司他丁组24h、72h sTM含量比较差异均无统计学意义（孕＞0.05）；24h、72h vWF含量比较差异均有统计学意义（孕＜0.05）。见表1。

2.2 电镜结果 脑出血造模后24h可见细胞核染色质边集，凝聚于核膜下，线粒体嵴突模糊，出现细胞凋亡的早期征象。UTI治疗24h可见细胞核染色质边集、浓缩，线粒体嵴突模糊，内有空泡形成；UTI治疗72h细胞核染色质继续边移，线粒体嵴突断裂，空泡增多，肿胀。依达拉奉治疗24h细胞核染色质边集、浓缩，线粒体嵴突断裂、空泡多，肿胀明显。依达拉奉治疗72h细胞核染色质浓缩成堆，出现凋亡晚期征象，线粒体嵴突消失、空泡融合，肿胀明显，图1A～5B（插页）。

表1 各组模型兔sTM及vWF变化（ng/mL，±s）

表1 各组模型兔sTM及vWF变化（ng/mL，±s）

注:与脑出血组比较，▲孕＜0.05；与依达拉奉组比较，★孕＜0.05；sTM:可溶性血栓调节蛋白；vWF:血管性假性血友病因子

组别脑出血组依达拉奉组乌司他丁组v W F只数s T M 1 0 1 0 1 0 0 h 4 . 5 3 ± 0 . 2 5 4 . 5 2 ± 0 . 2 2 4 . 5 3 ± 0 . 1 3 2 4 h 6 . 0 6 ± 0 . 1 9 4 . 6 1 ± 0 . 1 1▲4 . 8 2 ± 0 . 7 7▲7 2 h 6 . 4 2 ± 0 . 4 8 4 . 5 1 ± 0 . 1 0▲4 . 7 9 ± 0 . 7 5▲0 h 8 . 3 4 ± 0 . 4 6 8 . 3 2 ± 0 . 4 1 8 . 3 5 ± 0 . 4 7 2 4 h 1 0 . 0 2 ± 0 . 7 1 9 . 7 7 ± 0 . 4 6★9 . 0 9 ± 0 . 2 4▲★7 2 h 1 1 . 3 9 ± 0 . 6 3 9 . 6 4 ± 0 . 5 6▲★8 . 4 8 ± 0 . 7 3▲★

3 讨论

脑出血后血肿的压迫可致局部脑组织缺血缺氧，从而造成脑组织毛细血管内皮细胞的损伤。vWF 及sTM是目前研究较多的得到公认的内皮细胞标记物，可反映内皮细胞的功能状态。血浆高水平的vWF常伴随发生脑卒中的危险[4]，检测vWF水平，可作为脑血管疾病急性期内皮功能状态与受损程度的指标。

血栓调节蛋白（thrombomcdulin，TM）从内皮表面水解脱落，成为sTM而游离于血浆中，其水平升高幅度与血管内皮细胞损伤程度成正比[5]，当血管内皮细胞受损时加速断裂或脱落进入血循环中，依其浓度的变化可以评估患者血管内皮细胞损伤及疾病的严重程度，是反映血管内皮细胞损伤的敏感指标。在张子彦等[6]的研究中，血浆sTM在一定程度上可以反映过敏性紫癜患儿肾脏血管受损情况。而有效组sTM水平治疗后较治疗前降低。sTM水平变化与治疗效果密切相关。张建江等[7]根据紫癜性肾炎(HSPN)患儿不同的临床表现分组比较发现，sTM在血尿+蛋白尿组明显升高，表明内皮细胞的损伤程度越重，血尿及蛋白尿越明显。血管轻度损伤只有血管内皮细胞激活，如血管呈现中度或重度损伤，不仅血管内皮细胞的功能发生紊乱，而且出现血管壁结构的破坏。表明在HSPN的发病过程中血管内皮的损伤程度更加严重。同样，在脑出血后，出血灶周围脑组织中vWF及sTM含量越高，提示血管损伤越严重，可能导致血肿进一步扩大，明显加重病情。并且可能造成血肿周围的缺血，进一步加重血肿周围正常脑组织的缺血缺氧，甚至形成微梗死。因而，笔者认为在脑出血后有效控制血浆vWF及sTM含量，是防治脑出血后脑功能进一步恶化的有效方法之一。

依达拉奉是目前临床上应用最久的自由基清除剂，其具有清除氧自由基和抑制脂质过氧化的作用。依达拉奉可减轻脑出血后的细胞凋亡，对脑出血后神经损伤起保护作用[8]，可以抑制脑细胞（血管内皮细胞和神经细胞）的过氧化作用。体内试验显示，依达拉奉还能抑制血管内皮细胞损害，抑制脑水肿，改善神经功能。众多实验表明，UTI在保护血管内皮方面，具有与依达拉奉相近的功能和作用。在UTI对脓毒症大鼠血管内皮细胞功能保护作用的实验研究[9]中，UTI组vWF、sTM水平低于模型组（孕＜0.01），高于假手术组（孕＜0.01），表明UTI对脓毒症大鼠的内皮细胞具有保护作用。另一动物实验表明[10]，离断肢体在再植后动脉开放前静脉注射UTI能有效减轻血管内皮细胞的损伤程度,UTI组的vWF在术中动脉开放0.5小时较对照组有明显的改善。在UTI对心肺转流（CPB）患者sTM、vWF的影响的临床研究[11]中，应用UTI组患者血浆sTM、vWF水平变化于CPB开始至术后24h均升高,但观察组明显低于对照组（孕＜0.05），研究发现，在CPB期间UTI组sTM和vWF较对照组明显下降,提示UTI在CPB期间可减少血浆中sTM和vWF含量，对血管内皮细胞有保护作用。重症中暑患者在常规治疗基础上加用UTI治疗，对患者的血管内皮细胞具有一定的保护作用[12]。孙家艳等[13]在UTI对毛细血管渗漏综合征（CLS）患者血管内皮细胞的保护作用研究中发现，UTI组治疗后第2天开始sTM及vWF开始下降，至第7天恢复正常。提示UTI对CLS患者血管内皮细胞有保护作用，有良好的临床疗效。

本实验结果提示兔脑出血模型建立后，单独应用依达拉奉注射液治疗，脑出血兔模型的sTM在24h及72h均有明显下降，vWF在72h下降。而立即给予UTI注射液治疗，在24h及72h均可见到vWF 及sTM的下降。病理切片同样表明，应用UTI后脑出血病灶周围脑细胞线粒体嵴断裂、空泡增多、肿胀的变化比应用依达拉奉治疗延迟发生。因而单纯应用UTI较单纯应用依达拉奉在降低脑出血兔模型的sTM及vWF方面的脑保护作用更加明显。

综上所述，UTI可以降低急性脑出血模型兔血清sTM及vWF含量，可以延缓脑出血灶周围脑细胞线粒体破坏和细胞凋亡，具有一定的脑保护作用。UTI对于脑出血的脑保护作用仍需进一步深入研究。

［1］贾建平，陈生弟.神经病学［M］.第7版.北京:人民卫生出版社，2013:188.

［2］姜海涛，王逢鹏，谢江涛.乌司他丁脑保护作用研究进展［J］.临床神经外科杂志，2012，9（5）:310-313.

［3］刘文立，张生林.实验性脑出血大鼠急性期脑组织含水量与ET、NO含量的关系［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2010，8（11）:1348-1350.

［4］Wannamethee SG，Whincup PH，Lennon L，et al.Fibrin D-dimer，tissue-type plas minogen activator，von Willebrand factor，and risk of incident stroke in older men［J］.Stroke，2012，43（5）:1206-1211.

［5］蔡维艳，李爱敏，初清，等.血栓调节蛋白、血管性假血友病因子、基质金属蛋白酶-9在过敏性紫癜肾损害早期诊断中的价值［J］.实用儿科临床杂志，2012，27（17）:1340-1342.

［6］张子彦，王国平，徐瑞琴，等.成人过敏性紫癜患者血浆组织因子途径抑制物和可溶性血栓调节蛋白的变化及意义［J］.中华临床医师杂志，2013，7（18）:8493-8494.

［7］张建江，王华，郭喜霞，等.血浆和肾组织血栓调节蛋白的检测在儿童过敏性紫癜中的意义［J］.中华肾脏病杂志，2010，26（4）:308-309.

［8］陈达，刘艳，朱杰，等.依达拉奉对脑出血大鼠神经保护作用的实验研究［J］.中国现代医学杂志，2009，19（4）:497-502.

［9］俞兆希，石松菁，沈阳辉.乌司他丁对脓毒症大鼠血管内皮细胞功能保护作用的研究［J］.中华实用诊断与治疗杂志，2013，27（10）:968-972.

［10］徐韶怡，奚经巧，陈文东，等.乌司他丁对断肢再植中血管内皮细胞的保护作用［J］.浙江实用医学，2009，14（5）: 417-418.

［11］陈春，龚园，汤和青，等.乌司他丁对心肺转流患者血浆血栓调节蛋白、血管性假血友病因子、内皮素-1和一氧化氮水平的影响［J］.重庆医学，2010，39（8）:949-950.

［12］童华生，陈怿，唐柚青，等.乌司他丁对重症中暑患者血管内皮细胞损伤的影响［J］.广东医学，2011，32（12）: 1574-1576.

［13］孙家艳，夏仲芳，谈定玉.乌司他丁对毛细血管渗漏综合征患者血管内皮细胞的保护作用研究［J］.实用医学杂志，2014，30（2）:301-303.

（收稿:2016-03-20 修回:2016-05-12）

Effect of Ulinastatin on sTM and vWF and Tissue Pathology of the Brain of Rabbits with Acute CerebralHemorrhage

TONG Liyan1,SHI Xiuli2,XU Huanfeng3,FENG Weimin1. 1 Department of Neurology,Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310007),China;2 Eugenics Office,Hebei province Yutian County Family孕lanning Center Hospital Tangshan(064100),China;3 Department of Traditional Chinese Medicine,Hebei 孕rovince Shijiazhuang Yangtze River Mental Hospital Shijiazhuang(050000),China

ObjectiveTo observe arterial blood soluble thrombomodulin（sTM）,von Willebrand factor（vWF）and pathological changes of brain tissue specimens in rabbits with acute cerebral hemorrhage after ulinastatin（UTI）intervention,in an attempt to investigate the preventive effect of UTI on the brain.MethodsThirty rabbits successfully modeled were randomly divided into 3 groups：intracerebral hemorrhage（ICH）model group（M group）, edaravone treatment group（Y group）,and UTI treatment group（U group）,with 10 rabbits in each group.ELISA method was used to determine the content of vWF and sTM in the arterial blood and the pathological changes of brain tissues around acute cerebral hemorrhage in the rabbits were observed.ResultsCompared with those of M group[sTM（24h：6.06±0.19 ng/mL,72h：6.42±0.48 ng/mL）;vWF（24h：10.02±0.71 ng/mL,72h：11.39±0.63 ng/mL）],Y group had significantly lower content of sTM at the 24h（4.61±0.11 ng/mL）and 72h（4.51±0.10 ng/ mL,with孕＜0.05 and lower content of vWF at 72h（4.51±0.10 ng/mL）,with孕＜0.05;U group had both reduced contents of sTM and vWF at 24h（sTM：4.82±0.77 ng/mL,vWF：9.09±0.24 ng/mL）and 72h（sTM：4.79±0.75 ng/ mL,vWF：8.48±0.73 ng/mL）,all with signigicant differences（all孕＜0.05）.No significant difference in sTM at both time points was found between Y group and U group（孕＞0.05）,while significant differences in vWF was noted at both time points between the two groups（孕＜0.05）.Pathological results showed that the cells around the lesionof ICH in both U and Y groups appeared mitochondria crista broken and cytoplasmic vacuoles increased and cell swelling,but that those in U group were obviously lighter than those in Y group.Conclusion UTI can reduce serum content of sTM and vWF in acute ICH model rabbit,delay the damage of mitochondria and nucleus of the cells surrounding focal hemorrhage,which indicates that UTI has a certain brain protective effect.

rabbit;acute cerebral hemorrhage;ulinastatin;sTM;vWF

浙江省中医药卫生科技计划研究项目（No.2014ZB091）；天普科学研究基金资助项目（No.01200919）

1杭州市中医院神经内科（杭州 310007）；2河北省玉田县计生中心医院优生办公室（唐山 064100）；3河北省石家庄长江心理医院中医科（石家庄 050000）

佟丽妍，Tel:18905810196；E-mail:tong06315@163.com