NMR氢谱法分析市售奶油中的脂肪酸

李 玮,贾婧怡,姜 洁,毛 婷,李 龙

(北京市食品安全监控和风险评估中心,北京 100041)



NMR氢谱法分析市售奶油中的脂肪酸

李 玮,贾婧怡,姜 洁,毛 婷,李 龙

(北京市食品安全监控和风险评估中心,北京 100041)

在对奶油CDCl3提取物1H-NMR图谱主要信号峰归属的基础上,采用NMR氢谱法对市售的28个奶油中主要脂肪酸的相对摩尔含量进行了测定。结果显示,所测28 个市售奶油中亚麻酸的相对摩尔含量为0.55%～1.00%,亚油酸为0.59%～3.20%,丁酸为9.56%～12.59%,油酸为13.18%～21.01%,共轭亚油酸为0.34%～1.10%,饱和脂肪酸为74.95%～84.44%,其中人体必需脂肪酸总量(亚麻酸、亚油酸、共轭亚油酸)为2.16%～4.35%。此外,利用1D-TOCSY、J-RES、1H-1H COSY等多种NMR技术,鉴定出奶油中含有的1-戊烯成分,实现对食品复杂体系中非目标物的快速定性分析。

NMR氢谱法,奶油,脂类成分,脂肪酸组成,1-戊烯

奶油(butter,又称黄油)是以从鲜奶中提取的乳脂为原料加工而成的乳制品[1-2]。其主要成分为乳脂,含量约为80%～82%,同时含有蛋白质、维生素、矿物质等多种营养成分[3-4]。近年来,随着我国经济的增长和人们生活方式的转变,国内对奶油的消费量大幅增加。乳脂的营养价值主要取决与脂肪酸的组成,特别是人体必需脂肪酸的含量,因此测定奶油中主要脂肪酸含量对奶油质量控制、品质评价具有重要的意义。目前,对脂肪酸的分析多采用气相法(GC)、气相质谱联用法(GC-MS)等[5-8],这些方法存在着样品衍生化费时、毒性大,标准品昂贵,分析时间长等缺点。核磁共振(NMR)是有机物结构分析的强有力工具,1H-NMR的谱峰与样品中各化合物的氢原子一一对应,图谱中信号的相对强弱反映样品中各组分的相对含量,检测无偏性(即对样品中所有的物质具有相同的灵敏度),对食品等复杂体系的整体分析具有天然优势[9-12],已被用于多种植物油及其他脂类成分的分析中[13-17]。Andersson等[18]分别采用1H-NMR的谱法和AOAC的气相色谱法[19]对食用植物油中的主要脂肪酸测定结果进行了对比,结果显示两种方法的测定结果相近,但1H-NMR法具有前处理简便分析时间短,结构信息丰富等优点。

本研究首先对奶油样品氘代氯仿(CDCl3)提取物的NMR氢谱进行了系统归属,在此基础上,使用反转门控去耦的1H-NMR脉冲序列对市售的28 个奶油中主要脂肪酸的相对摩尔含量进行了测定。本方法操作简便,在对主要脂肪酸等目标物进行分析的同时,还对非目标物的定性分析,为奶油等乳制品的品质评价和食品安全监控工作提供了新的方法和思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

28个奶油样品(15个 品牌) 本市超市,置于4 ℃冰箱保存;标准品:丁酸、亚油酸、共轭亚油酸、亚麻酸、1-戊烯、胆固醇 美国SIGMA公司;氘代氯仿(CDCl3,氘代度:99. 8%) 美国CIL公司。

Bruker AVANCE 600MHZ NMR超导傅立叶变换核磁共振仪(配有BBO探头和topspin3.2处理软件) 瑞士Bruker公司;XS204电子天平 瑞士Mettler Toledo公司;Centrifuge 5424R离心机 德国Eppendorf公司;TissueLyser Ⅱ均质器 德国Qiagen公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 分别称取适量丁酸、亚油酸、共轭亚油酸、亚麻酸、1-戊烯、胆固醇标准品,用CDCl3溶解并定容,摇匀,制得标准品储备液,-20 ℃冰箱中储存备用,使用时按实际需求用CDCl3稀释后使用。

1.2.2 样品溶液的制备 称取奶油样品约150 mg于2 mL离心管中,加入1 mL CDCl3,置于均质器中均质40 s(30 Hz)后放入离心机中,4 ℃条件下离心10 min(8000 r/min)。移取600 μL离心后得到的清液于5 mm核磁管中,待测。

1.2.3 NMR测定条件 参考文献[17] 进行定性分析实验:1H-NMR、J-RES、1H-1H COSY使用Bruker标准脉冲程序,检测温度均为297 K,扫描次数NS分别为64、16、16 次;1D-TOCSY实验使用selcssfdizs.2脉冲,混合时间D9设为0.8 s。

脂肪酸相对含量实验:使用Bruker标准脉冲序列noesyig1d,检测温度为297 K,1H的90 °脉冲宽度P1为10.04 μs,谱宽SWH为6002.40 Hz,中心频率O1P为2400.52 Hz,脉冲延迟时间D1为20 s,混合时间D8为0.01 s,13C的去耦序列90°脉冲PCPD2为260 μs,扫描次数NS为16,空扫次数DS为4。

1.2.4 样品测定 在上述实验条件下,调整仪器参数、调谐、控温、匀场、采样,得到1H-NMR图谱。所有图谱使用Bruker Topspin 3.2软件处理,变换点数为65536,用指数窗函数处理,LB为1.00 Hz,以TMS定标,基线和相位校正均采用手动方式进行。

2 结果与讨论

2.11H-NMR图谱的指认与分析

奶油中主要脂类成分为甘油三酯,图1所示的是一张典型奶油样品脂类成分的1H-NMR(CDCl3)谱图,图谱显示主要存在A～I九组信号峰,根据文献报道[20-21],对这九组主要信号峰进行了归属(表1)。根据1H-NMR谱中化学位移和信号裂分模式以及1D-TOCSY、1H-1H COSY、J-RES等多种NMR谱所提供的偶合信息,并参考文献和相关脂肪酸标准品实验数据对1H-NMR谱中其他信号峰进行详细的归属。结果显示,在1H-NMR高场区域(图2Ⅰ),δ0.68(a)处明显的单峰为胆固醇13位上角甲基质子信号[22]。δ0.93～0.99处有一组重叠信号,J-RES数据显示此处有δ0.95(t,7.4Hz,b)和δ0.98(t,7.5Hz,c)两个三重峰,采用1D-TOCSY技术,分别对两个质子进行精确选择性照射,得到了2个质子耦合体系(图3Ⅰ、图3Ⅲ):(0.95(t)-1.65(dt)-2.30(t)、(0.98(t)-1.26～1.32(m)-1.65(m)-2.30(m)-2.81(br t)-5.29～5.41(m),结合文献报道[3],得知这两个耦合体系分别为甘油三酯中丁酸和亚麻酸链上质子,而δ0.95和δ0.98这两个三重峰分别为甘油酯中丁酸和亚麻酸的末端甲基质子,δ2.81(br t,d2)为甘油酯中亚麻酸脂肪链上两个双键之间亚甲基质子。同样采用1D-TOCSY技术对高场区δ2.77(t,6.8 Hz,d1)处的信号进行精确激发,得到了1个质子耦合体系(图3Ⅱ),经分析确认此峰为甘油酯中亚油酸脂肪链上两个双键之间亚甲基质子信号[14]。在1H-NMR低场区域(图2Ⅱ),δ3.73(e1)和δ5.08(e2)分别为1,2-二酰基甘油中丙三醇3位亚甲基和2位次甲基质子信号[13]。1D-TOCSY图谱(图3Ⅴ)结合文献报道[17],确认δ5.65(g1)、δ5.94(g2)和δ6.28(g3)信号为共轭亚油酸不饱和质子信号。

图1 奶油CDCl3提取物的1H-NMR图谱Fig.1 1H-NMR spectrum of CDCl3 extracts from butter

信号峰化学位移(ppm)归属基团A075～099-CH3B111～147-(CH2)n-C157～168-OCO-CH2-CH2-D192～214-CH2-CH2=CH2-E226～238-OCO-CH2-F275～285=CH-CH2-CH=G410～438-CH2OCORH524～529>CHOCORI530～543-CH=CH-

图2 奶油CDCl3提取物的1H-NMR图谱放大图Fig.2 1H-NMR spectrum of butter extracts from CDCl3注:图Ⅰ为高场放大图,图Ⅱ为低场放大图。a:胆固醇13位上角甲基质子信号;b:甘油酯中丁酸末端甲基质子;c:甘油酯中亚麻酸的末端甲基质子;d1:甘油酯中亚油酸脂肪链上两个双键之间亚甲基质子信号;d2:甘油酯中亚麻酸脂肪链上两个双键之间亚甲基质子;e1、e2:分别为1,2-二酰基甘油中丙三醇3位亚甲基质子信号和2位次甲基质子信号;f1、f2、f3:分别为1-戊烯两个末端双键亚甲基质子信号和一个末端双键次甲基质子信号;g1、g2、g3:为共轭亚油酸不饱和质子信号。

2.2 非目标物的结构解析

在δ4.91～δ5.01间包含一组信号较强且分辨率较高的峰,通过J-RES谱,确认这是δ4.93(br d,10.1Hz,f1)和δ4.99(br d,16.8 Hz,f2)两个信号峰,耦合常数分别在10和15左右,具有典型的顺式双键质子和反式双键质子特征。通过1H-1H COSY图谱,可以观察到这两处信号均与(5.80(f3)处信号峰相关,得出δ4.93和δ4.99为末端双键亚甲基质子信号,(5.80为末端双键次甲基质子信号。采用1D-TOCSY技术,对其中的δ4.93进行选择性照射,得到了1个质子耦合体系(图3Ⅵ):0.88-1.26-2.05-δ4.93(br d)-δ4.99(br d)-5.80(m),提示我们这可能是一个正烯烃类化合物。有研究表明,亚油酸等ω-6不饱和脂肪酸在发生过氧化反应时可产生1-戊烯[23],通过向样品中添加标准品的方法,确证此化合物为1-戊烯(1-pentene,图4)。氢谱归属如下:1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.80(1H,m,H-2),4.99(1H,br d,J=16.8 Hz,H-1b),4.93(1H,br d,J=10.1 Hz,H-1a),2.05(2H,m,H-3),1.26(2H,m,H-4),0.88(3H,m,H-5)。

图3 奶油CDCl3提取物选择性照射1H的1D-TOCSY图谱Fig.3 1D-TOCSY spectrum of CDCl3 extracts from butter with selective excitation of 1H 注:选择性照射位点:Ⅰ(δ0.95),Ⅱ(δ2.77), Ⅲ(δ0.98),Ⅳ(δ4.93),Ⅴ(δ6.28)。

图4 1-戊烯的结构图Fig.4 Molecular structures of 1-pentene

2.3 定量实验采样参数的确定

驰豫过程是核磁共振现象发生后得以保持的必要条件,其中纵向弛豫时间T1代表纵向磁化强度向平衡态回复的动态过程常数。在实验中应选取合适的驰豫延迟时间,保证谱峰强度不会被饱和,这样才有利于得到正确的结果。所以,为了避免造成样品饱和,一般D1≥5T1。通过反转恢复法测得用来定量分析峰的弛豫时间T1为0.60～3.80 s,所以,选取D1=20.0 s。NS为定量实验扫描次数,较少会造成数据重现性差,较多会使数据重现性好,提高信噪比,但同时也会延长实验时间。在本研究中,NS取16 次时含量最少的CLA的定量峰的信噪比超过100,即可得到较好的信噪比,满足分析的要求,因此选取NS=16 次。

2.4 脂肪酸含量测定

根据上述对1H-NMR中各质子峰的归属,可知δ2.81(图2,d2)为亚麻酸脂肪链上两个双键之间亚甲基质子信号,δ0.75～0.99(图1A)信号为奶油中所有脂肪链末端甲基质子信号。在1H-NMR中,共振峰面积与该共振峰的质子数成正比,因此可以按公式(1)计算奶油样品中亚麻酸占总脂肪酸的摩尔比[21],其中A表示积分面积,下角标代表积分峰名称,下同。

亚麻酸(%)=3Ad2/4AA

式(1)

同理,亚油酸、丁酸、共轭亚油酸、油酸及饱和脂肪酸占总脂肪酸的摩尔比分别可按公式(2)、(3)、(4)、(5)、(6)进行计算。

亚油酸(%)=3Ad1/2AA

式(2)

丁酸(%)=[(Ab+Ac)/AA]-亚麻酸(%)

式(3)

共轭亚油酸(%)=(Ag1+Ag2)/AA

式(4)

油酸(%)=(3AD/4AA)-亚麻酸(%)-亚油酸(%)-丁酸(%)

式(5)

饱和脂肪酸(%)=1-亚麻酸(%)-亚油酸(%)-油酸(%)-共轭亚油酸(%)

式(6)

表2 奶油中脂类成分主要脂肪酸占中脂肪酸的摩尔比(n=3)
Table 2 Molar percentages of the different types of acyl groups in the butter subject of study determined by1H-NMR(n=3)

样品编号亚麻酸(%)亚油酸(%)丁酸(%)油酸(%)共轭亚油酸(%)饱和脂肪酸(%)1074±001114±0021129±0101529±015064±0028219±0182067±002141±0041100±0011914±194051±0037827±1923062±001120±0031102±0031709±096034±0018075±0944081±003119±0031135±0041890±178084±0077827±1805089±001115±0031193±0011835±013094±0047867±0176073±001116±0071116±0021488±035056±0028266±0317066±001122±0011118±0041978±058051±0027783±0578069±002139±0041105±0091753±034054±0047985±0379083±002066±0011208±0011638±057109±0028103±05810074±002056±0041211±0041358±032106±0098405±04711095±001224±0051119±0082101±230085±0037495±22312089±001067±0011259±0041750±041097±0017997±03913069±003123±002112±0071801±060062±0027944±06514100±001091±0041247±0271476±074083±0018251±07315084±001064±0051114±0031946±029110±0027796±03316070±002126±0041112±011878±264065±0047861±25817063±001127±0031096±0061825±052054±0027932±05118079±002059±003114±0141406±068090±0038366±07319064±001126±0041093±0121318±045048±0018444±04120062±002122±004113±0121534±049049±0028233±04821058±003132±0071100±0071342±045040±0018427±04522067±002121±0021083±0021692±060042±0028077±06023070±002187±0031052±0081538±073038±0038166±08024058±00132±001956±0071700±010057±0017865±01125057±001319±006961±0061690±034054±0047879±04426088±002111±0041125±0071444±043090±0018267±04827065±003125±0031127±0081568±350053±0028190±35628055±001122±0041084±0061683±137043±0038097±136

称取不同品牌的奶油样品,制备供试品溶液,测定1H-NMR图谱,根据上述计算方法计算样品中各脂肪酸的相对摩尔含量,结果见表2。结果显示,所测定的28 个市售品牌奶油中亚麻酸的含量为0.55%～1.00%,亚油酸为0.59%～3.20%,丁酸为9.56%～12.59%,油酸为13.18%～21.01%,共轭亚油酸为0.34%～1.10%,饱和脂肪酸为74.95%～84.44%,其中人体必需脂肪酸总量(亚麻酸、亚油酸、共轭亚油酸)为2.16%～4.35%。

3 结论

本研究对28 个奶油中主要脂肪酸进行测定,结果显示,各品牌奶油中亚麻酸、亚油酸、油酸、共轭亚油酸等不饱和脂肪酸的相对含量相差较大。奶油成分复杂,因其原料乳组分受牧草生长、饲料来源、奶牛的年龄和泌乳期的影响,奶油脂肪酸的组成呈现明显的季节性和区域性变化[2]。这提示我们不同的原料产地、制作工艺及存放条件可能会导致奶油中主要不饱和脂肪酸含量的不同,这也为今后奶油等乳制品的品质评价、掺假鉴别等提供可参考的基础数据。

此外,本研究利用1D-TOCSY、J-RES、1H-1H COSY等多种NMR技术,对奶油CDCl3提取物1H-NMR图谱进行了系统研究和归属,并鉴定出其中含有的1-戊烯成分,实现了食品复杂基质中非目标成分的定性分析。这充分显示出高场核磁共振技术在食品等复杂混合物体系中对非目标成分快速定性的优势,为主动发现食品中存在风险积累成功经验。

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1H-NMR analysis of fatty acid composition of commercially available butter

LI Wei,JIA Jing-yi,JIANG Jie,MAO Ting,LI Long

(Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment,Beijing 100041,China)

In this study,the main signal peaks of1H nuclear magnetic resonance spectroscopy(1H-NMR)in CDCl3extracts of butter were assigned by a few different NMR experimental methods. Then the fatty acid composition of butter were determined upon analysis of1H-NMR spectra. Twenty-eight brands of commercially available butter were determined in the study. The results showed that the relative molar contents of linolenic acid,linoleic acid,butyric acid,oleic acid,conjugated linoleic acid(CLA)were 0.55%～1.00%,0.59%～3.20%,9.56%～12.59%,13.18%～21.01%,0.34%～1.10%,and the contents of saturated fatty acids(SFA)and essential fatty acid(linolenic acid,linoleic acid,CLA)were 74.95%～84.44% and 2.16%～4.35%. In addition,1-pentene in CDCl3extracts of butter was identified by 1D-TOCSY,J-RES,1H-1H COSY spectra. The result suggest that this method can not only clarify the target but also non-target components in butter.

1H nuclear magnetic resonance spectroscopy(1H-NMR);butter;lipidic components;fatty acid composition;1-pentene

2016-06-23

李玮(1984-)，女，博士，高级工程师，研究方向：食品营养与安全， E-mail:liwei@bjmu.edu.cn。

北京市优秀人才培养资助项目( 20140000204400001)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)23-0319-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.051