基于双指标分析法和聚类分析法的白刺红外指纹图谱比较研究

赵 薇,陈奕君,孟庆艳,乜 广,张 玲,*,李 莹,刘 圆

(1.西南民族大学药学院，四川成都 610041;2.北京中医药大学中药学院，北京 100029;3.新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室,新疆阿拉尔 843300;4.西南民族大学民族医药研究院,四川成都 610041)



基于双指标分析法和聚类分析法的白刺红外指纹图谱比较研究

赵 薇1,陈奕君2,孟庆艳3,乜 广3,张 玲3,*,李 莹1,刘 圆4,*

(1.西南民族大学药学院，四川成都 610041;2.北京中医药大学中药学院，北京 100029;3.新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室,新疆阿拉尔 843300;4.西南民族大学民族医药研究院,四川成都 610041)

采用双指标序列分析法和聚类分析法对7种不同白刺属植物的红外指纹图谱进行比较分析,利用共有峰率和变异峰率2个指标,以不同来源样品的红外指纹图谱为标准,计算出所测样品间的共有峰率和变异峰率,并按照共有峰率的大小建立不同的双指标序列分析法,研究各产地白刺的异同。结果表明:不同来源的植物样品中G3与G6的成分最为相似,相似度为57.89;G3与G5次之,相似度为52.63;G1、G7与其他各样品的相似程度最低。红外光谱指纹图谱结合聚类分析或双指标序列法,可以快速、无损地鉴别不同产地的白刺,为区别不同产地不同品种白刺提供一种切实可靠的方法。

白刺,红外指纹图谱,共有峰率,变异峰率,双指标序列法,聚类分析

表1 样品来源
Table 1 Sample source

样品名称来源采集时间G1小果白刺NitrariasibiricaPall新疆克州阿合奇县2010年4月G2泡泡刺NitrariasphaerocarpaMaxim新疆巴州和硕县2010年3月G3泡泡刺NitrariasphaerocarpaMaxim新疆阿克苏柯坪县2010年4月G4帕米尔白刺NitrariapamiricaVassil新疆喀什塔县至阿克图途中2010年4月G5泡泡刺NitrariasphaerocarpaMaxim新疆巴州和硕县2010年4月G6大白刺NitrariaroborowskiiKom新疆阿克苏新和县2010年4月G7白刺NitrariatangutorumBobr新疆巴州和静县拉音克草原2010年4月

白刺属(NitrariaL)为蒺藜科的一个古老小属,自然分布在干燥、盐碱、多风、植被稀少的严酷环境中,其有很强的抗逆性,是典型的旱生或超旱生荒漠植物[1]。目前全世界已发现13种,我国分布有8种,资源十分丰富,主要分布西北地区及内蒙古等地[2]。白刺果味甜带酸,有“沙漠樱桃”的美称[3],具有很高的营养价值,富含氨基酸、维生素、黄酮、皂苷、生物碱、矿物质等营养元素和活性成分[4],民间用于治疗脾胃虚弱、消化不良、神经衰弱、乳汁不下等症状,其叶亦作为民间药用于治疗痉挛、心律不齐及神经痛等症[5]。目前关于白刺的报道,主要集中在环境保护及生理特性研究,对其化学成分分析报道较少。红外指纹图谱能够反映中药材各种化学成分的整体信息,其操作简单,测试速度快成本低,便于两个及以上样品之间的比较,所得结果专属性强,准确性高,应用范围广等优点,目前已成为中药材、食品、水果等产地鉴别的重要手段[6-7]。

近年来,红外指纹图谱的共有峰率和变异峰率的双指标分析法作为一种新的算法,可以在2+n维空间中考察不同样品之间的相互关系,并能比较精确地知道任意一个样品与其他样品的远近关系,且对实验样没有严格的要求。系统聚类分析法,在生物学领域也被广泛应用,但目前还未见用上述方法研究白刺的报道。本实验采用FTIR技术,以共有峰率及变异峰率双指标序列法和系统聚类分析法分析七种白刺属植物样品红外指纹特征,并进行归类比较,旨在为白刺属植物质量评价提供简单可靠的分析方法[8-9]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白刺全株 共7批,分别来源于6个不同产地,均经塔里木大学孟庆艳副研究员分别鉴定为白刺属植物:小果白刺NitrariasibiricaPall.、泡泡刺NitrariasphaerocarpaMaxim.、帕米尔白刺NitrariapamiricaVassil.、大白刺NitrariaroborowskiiKom.、白刺NitrariatangutorumBobr.,样品来源见表1。

Nicolet380(K)傅立叶红外光谱仪(扫描范围为400～400 cm-1,分辨率选择为4 cm-1) 赛默飞世尔科技公司;YP-2 压片机 上海山岳科学仪器公司;DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;KBr光谱纯 天津市光复精细化工研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 测试样品制备 取原药材,于60 ℃烘箱中干燥48 h,粉碎,过200目筛,称取药材粉末若干分别与干燥后的溴化钾粉末样品,按1∶10比例混合,于红外灯照射条件下在玛瑙乳钵中研磨均匀,装入压片模具,在抽真空状态下用油压机以 27 MPa 压力压制 2 min,然后用镊子小心取下压片(厚度约 1 mm),装入样品架进行分析测试。不同样品分开研磨,压片器每次使用均需处理干净。

1.2.2 红外光谱测定 以KBr为背景累积扫描32次,每个样品平行测3次,取其平均光谱图,所有光谱图均扣除KBr背景光谱。原始光谱数据首先经OMNIC软件编写的程序进行多点基线校正,除去基线影响,接着采用移动平均平滑,然后将预处理后的光谱数据导入软件Unscrambler 9.1进行标准归一化(standard normalvariate,SNV),去除不同样本称量的差异。

1.2.3 红外指纹图谱共有峰率和变异峰率双指标的建立 本实验主要以不同产地的7个白刺属植物为实验材料,识别其红外指纹图谱吸收峰,建立其红外指纹图谱共有峰率和变异峰率双指标序列分析法[10-11]。即:

P(共有峰率)=Ng(共有峰数)/Nd(两个IR图中的独立峰数)×100%

N(共有峰数):指在比较的两个IR图中都出现的吸收峰的个数

n(独立峰):红外指纹图谱中不同的吸收峰

na:指纹图谱a中相对与其共有峰的非共有峰数,称为a 的变异峰数

nb:指纹图谱b中相对与其共有峰的非共有峰数,称为b 的变异峰数

Nd:独立峰数,相互比较的两个IR图中的独立峰总数Nd=Ng+na+nb

Pv:变异峰率(变异鉴别指标,一个指纹图谱的变异峰率)

P:该IR图中相对于共有峰的变异峰数与其共有峰数的比值

Pva:指纹图谱a 的变异峰率 Pva=(na÷Ng)×100%

Pvb:指纹图谱b 的变异峰率 Pvb=(nb÷Ng)×100%

Na:指纹图谱a的总峰数 Na=Ng+na

Nb:指纹图谱b的总峰数 Nb=Ng+nb

1.2.4 重复性实验 在相同条件下,平行测定6份同一个来源的样品,结果表明,红外指纹图谱具有良好的重复性,共有峰率大于80.0%。

1.3 数据处理方法

1.3.1 双指标序列法 以不同样品为参考,以指纹图谱共有峰率和变异峰率计算公式,分别计算其他样品红外指纹图谱的共有峰率和变异峰率,并且根据共有峰率的大小排成一个序列(包含共有峰率和变异峰率值),该序列称为共有峰率和变异峰率双指标序列,n个样品可得n个不同的序列,故可构成2+n维序列空间[12]。

1.3.2 聚类分析 从图1中可知 1750～850 cm-1波段范围内吸收峰的位置和吸收强度差异较为明显,具有一定的特征性和指纹性,提取该波段的透过率值作为聚类分析的原始数据。取不同产地样本的平均图谱,基于欧式距离,运用SPSS 19.0对白刺和泡泡刺的红外光谱进行分析,以不同波数段上的吸光度为指标,7个样品之间欧氏距离系数在0～25之间。

2 结果与分析

2.1 白刺的红外指纹图谱及数据

将7批白刺样品按照“1.2.1”及“1.2.2”下实验方法进行远红外光谱测定,其样品无损检测叠加红外指纹图谱见图1。其中3389.7 cm-1是由蛋白质 N-H 伸缩振动、糖分子中O-H伸缩振动以及不饱和脂肪酸中=C-H 伸缩振动引起,该峰是明显的宽而强的吸收峰;2920.5 cm-1及2853.2 cm-1处小肩峰分别代表亚甲基的顺式伸缩振动与反式伸缩振动,吸收强度中等;1745.4 cm-1是由酯C=O伸缩振动引起,吸收强度较弱;1653.5 cm-1为酰胺Ι键特征吸收[13-14](蛋白质酰胺键 C=O 伸缩振动以及N-H面内弯曲振动频率与部分 C-N 伸缩振动频率偶合产生的吸收峰)及不饱和脂肪酸 C=C 伸缩振动引起,是很强的吸收峰;结果分析表明:虽然不同产地的白刺样品的红外光谱基本一致,但在吸收峰的数目、形状和强度等方面仍存在一定差异。而图谱直接比对得到的信息有限且不利于分析结果的量化显示,需结合其他方法获取更多的信息。

图1 样品的红外光谱叠加图Fig.1 The overlapping IR fingerprint spectra of sample注:图中最左侧波数为4000 cm-1时,从上至下依次是样品G1～G7。

共有峰的确定方法:对于一组吸收峰,若组内的吸收峰的波数最大差异显著小于其与相邻组之间的平均波数差,并且每个样品都存在该组峰的波数,可确定该组峰是一组共有峰。在表2中,多数组峰很明显满足这种确定方法,它们可以明确判定为共有峰。例如551.23 cm-1对应的组峰与邻近的组峰较为接近,551.23 cm-1对应组峰的平均波数为548.91 cm-1,组内最大波数差为5.31 cm-1,该组的平均波数与前后临近的两组峰的平均波数差分别为12.14 cm-1和13.0 cm-1,两个值明显大于5.31 cm-1,故可确认551.23 cm-1对应的一组峰是共有峰[15],表2中属于同一列的吸收峰为共有峰。

表2 白刺红外指纹图谱波数及共有峰识别结果
Table 2 The wavenumber and common peaks of FTIR spectra ofNitrariaL

样品红外指纹图谱吸收峰波数(cm-1)G1336840292196284963173350163409140777-G2335255292655--165157141147-G3333730292931--164576-138500G4336363292592--164525140372-G5336363292718--164567-138431G6335778292978--163987141941-G7335772291993--163580-138448G1132007124974107913---60531G2131662126109106287--62866-G3132036-10616866843660136152560530G4131713124560107200--6217859615G5132109123708106501--61822-G6131447-107033-661046164460241G7--106559--61911-G157453-5512353434-5155749477G25763455861-5332652975--G3-56160---5189449889G4---541675244851226-G5---5379752838-49477G657571-5495853677-5184149179G757453562965459253148---G1475664613845653-G2--4572043373G347632--43875G4---43578G54761746032-43874G648007463004531243858G748117463804492644000

表3 红外图谱共有峰率和变异峰率双指标序列分析结果
Table 3 Dual-index sequential analysis of common and variant peak ratioin infrared fingerprint ofNitrariaL

样品共有峰率和变异峰率G1G1∶G6(7143；20，20)G4(5263；80，10)G2(455；80，40)G5(4545；80，40)G7(4286；8889，4444)G3(375；100，6667)G2G2∶G4(6875；272，6364)G3(6154；75，875)G7(5556；40，40)G5(5294；4444，4444)G6(5238；2727，6364)G1(4545；80，40)G3G3∶G2(6154；75，875)G6(5789；2727，4545)G5(5263；50，40)G4(4737；6667，4444)G7(45；6667，5556)G1(375；100，6667)G4G4∶G2(6875；2727，1818)G5(5882；30，40)G6(55；1818，6364)G1(5263；80，10)G3(4737；6667，4444)G7(35；8571，100)G5G5∶G4(5882；30，40)G7(5556；40，40)G2(5294；4444，4444)G3(5263；50，40)G6(5238；2727，6364)G1(4545；80，40)G6G6∶G1(7143；20，20)G7(60；50，166)G3(5789；2727，4545)G4(55；1818，6364)G5(5238；2727，6364)G2(5238；2727，6364)G7G7∶G6(60；50，1667)G2(5556；40，40)G5(5556；40，40)G3(45；6667，5556)G1(4286；8889，4444)G4(35；8571，100)

2.2 双指标序列法结果分析

本实验以7个样本为参照点,建立共有峰率和变异峰率双指标序列,形成多维序列空间利用该多维双指标序列空间可以方便地找到某一样品的最相近样品,从而可以避免在单一序列空间中比较不同样品。表3中,G1:G4(52.63;80,10)表示该序列以G1为标准计算其他样品指纹图谱的共有峰率和变异峰率,该序列片段表示G1与G4的共有峰率为52.63,相对于共有峰率的变异峰率分别为G1为80,G4为10。

2.3 基本关系组、对及分析

A组:G7∶G2(55.56;40,40) G7∶G5(55.56;40,40) G6∶G5(52.38;27.27,63.64) G6∶G2(52.38;27.27,27.27)

B组:G2∶G5(52.94;44.44,44.44) G2∶G6(52.38;27.27,63.6 4) G5∶G3(52.63;50,40) G5∶G6(52.38;27.27,63.64)

C组:G5∶G4(58.82;30,40) G5∶G7(55.56;40,40) G3-G4(47.37;66.67,44.44) G3-G7(45;66.67,55.56) G1∶G5(45.45;80,40) G1∶G7(42.86;88.89,44.44)

A组中G2与G5相对于G7和G6有相同的共有峰率和变异峰率,分别为(55.56;40,40)和(52.38;27.27,63.64),由此可见二者的成分最为接近。

B组中G2、G3、G6相对于G5有相近的共有峰率,变异峰率相差也较小;G6、G5相对于G2的共有峰率很接近,变异峰率相差也较小;由此可见G2、G3、G6、G5的成分很接近。

C组中G4、G7相对于G5和G3,G5、G7相对于G1有较为接近的共有峰率和变异峰;由此可见G4与G7、G5与G7的成分较为接近。G1与其他样品的差异最大,G7与其他样品的差异也较大。

2.4 各样品光谱特征聚类分析

通过图2可知,各测试样品可分为3个表征群,G2与G4首先聚在一起,然后G3与G6、G5、G7聚在一起,G1自己归为一类。

图2 白刺属样品聚类分析树状图Fig.2 Hierachical clustering analysis of the Nitraria L sample

3 结论

3.1 双指标序列分析法结果

通过双指标序列分析法分组,得到A组、B组、C组,可以看出G2与G5化学成分最为相近;其次是G2与G3、G5与G6较为接近,差异较大的是G4、G5、G7;G1与其他样品的差异均很大。总体看来,G2与G5为同一地区同种植物,成分最为接近,而且采集地相近的样品则较为相似,由此可见双指标序列分析法可以准确的将各样品完全分开,细致的描述各样品之间差异的大小。

3.2 聚类分析法结果

聚类分析将样品分为三组:G2与G4一组;G3、G6、G5、G7一组;G1与其他样品的差异较大;由此可见聚类分析可以大体上将样品区分开,同时能够较为准确的描述各样品之间的差异。

3.3 结果对比分析

从两种分析方法可以看出,双指标序列分析法及聚类分析法均可以分析白刺指纹图谱数据。在实际应用过程中,上述两种方法均有特点,双指标序列法能够精确辨认出关系最近的样品,但共有峰率及变异峰率的计算较繁琐;聚类分析相对简便,但其精确度低于双指标分析法,只适合一般归类,因此在样品量不大时,两种方法均可应用于药材质量评价,样品量较大时,应用聚类分析法相对简便。两种分析方法结果总体上没有表现出较好的统一性,可能是由于应用系统聚类分析法时,只做了初始数据聚类分析。

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Comparative study on the infrared fingerprint of nitraria tangutorum bobr. based on the methods of sequential analysis of dual-indexes and cluster analysis

ZHAO Wei1,CHEN Yi-jun2,MENG Qing-yan3,NIE Guang3,ZHANG Ling3,*,LI Ying1,LIU Yuan4,*

(1.College of medicine,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China; 2.School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China; 3.Biological Rsource Protection and Utilization Keystone Lab of Tarim Basin,Alaer 843300,China; 4.Ethnic medicine institute,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

The method of sequential analysis of dual-indexes and cluster analysis were utilized to investigate the infrared fingerprints of 7 plant species of the genusNitrariaL.Using common peak ratio index and variant peak ratio index,based on IR fingerprint ofNitrariaL. from different regions,common peak ratio and variant peak ratio of 7 samples were calculated respectively to set up a new method called dual-index sequence analysis for distinguishing samples from different regions. The result showed that the compositions of G3 and G6 were the most similar,and the similarity was 57.89,in different plant samples. The similarity between G3 and G5 was 52.63,the similarity among G1,G7 and other samples were the lowest.On the whole,FTIR combined with cluster analysis or sequential analysis of dual-indexes provided an effective way to identify the regions ofNitrariatangutorumBobr. rapidly and simply,For the difference between different regions of different varieties of white provided a practical and reliable method.

NitrariaL;IR fingerprint;common peak rate;variation peak rate;double index sequence method;clustering analysis

2016-05-12

赵薇(1992-)，女，在读硕士研究生，研究方向：民族药品种、质量和新药资源保护与利用，E-mail:18215652992@163.com。

*通讯作者:张玲(1977-)，女，硕士，副教授，主要从事植物分子生物学研究，E-mail:zhlzky010@163.com。 刘圆(1968-)，女，博士，教授，主要从事民族药物的教学和科研工作，E-mail:499769896@qq.com 。

“十三五”国家科技支撑计划(2015BAC05B02)；四川省科技支撑计划(2014SZ0159)；中央高校基本科研业务费专项基金项目(2015NZYQM46)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)23-0286-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.045