南极磷虾抗冻蛋白的特异性亲和吸附提取研究

马庆保,陈雪忠,刘志东,*,曲映红,汪一红,王 帅

(1.中国水产科学研究院东海水产研究所,上海 200090; 2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)



南极磷虾抗冻蛋白的特异性亲和吸附提取研究

马庆保1,2,陈雪忠1,刘志东1,*,曲映红2,汪一红1,王 帅1,2

(1.中国水产科学研究院东海水产研究所,上海 200090; 2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)

本文以南极磷虾蛋白为原料,以南极磷虾抗冻蛋白(Antifreeze proteins,AFPs)的得率为指标,开展了特异性亲和吸附法提取南极磷虾AFPs的工艺研究。本文在单因素实验的基础上,通过响应面优化实验研究样品浓度、吸附温度、吸附时间、吸附次数对南极磷虾AFPs得率和热滞活性(Thermal Hytersis Activity,THA)的影响。结果表明,南极磷虾AFPs的最优提取条件为:样品浓度1.0 mg/mL、吸附温度-1.70 ℃、吸附时间为11 h、吸附次数为2次。在上述条件下预测南极磷虾AFPs的得率为29.34%,THA为0.0805 ℃;验证值与预测值之间的误差分别为2.66%和1.86%。这表明该模型可以用于预测南极磷虾AFPs的提取优化。本文的研究结果为南极磷虾AFPs的深入研究提供技术支撑。

南极磷虾,抗冻蛋白,特异性亲和吸附,响应面法,优化

抗冻蛋白(Antifreeze proteins,AFPs)是一类可以非依数性地降低体系的冰点、改变冰晶形态、抑制冰晶生长的特殊蛋白质,亦称热滞蛋白(Thermal hysteresis proteins,THPs)、冰结合蛋白(Ice binding proteins,IBPs)或冰结构蛋白(Ice structuring proteins,ISPs)[1]。AFPs是生物体抵御低温胁迫所产生的一类物质[2]。1969年,A.L.DeVries在南极鱼(Trematomus borchgrevinki)的血液中发现了AFPs的存在[3]。随后,不同物种来源的AFPs相继被发现。

南极磷虾(Euphausiasuperba)是一种生活在南极海域的小型浮游类海洋动物,生物资源量巨大,目前处于尚未充分开发利用的状态,具有良好的开发应用前景[4-5]。由于南极磷虾生活于寒凉的南极海域(水温约为-1.9 ℃)[6],为了适应南极海域严苛的低温环境,南极磷虾适应性地产生了抗冻活性物质(课题组已在前期研究中发现了南极磷虾AFPs的存在)。由于AFPs良好的热滞活性和冰晶生长抑制特性,其在冷冻食品、器官移植等领域具有广泛的应用潜力[7]。目前,商业化应用的抗冻剂存在副作用大,价格较高,来源受限等问题。目前,植物来源,鱼类及陆地动物来源的AFPs研究较多,如小麦,猪皮、沙冬青等。由于受原料来源、提取条件等因素的限制,商业化的天然来源抗冻剂还较少[8]。因此,开发来源广泛、价格低廉,安全性高的天然抗冻剂具有非常迫切的需求。

AFPs的分离纯化方法主要包括层析分离法、电泳分离法、浊点萃取法、真空渗透离心法等[9-11]。研究发现,上述 AFPs分离纯化方法存在分离纯化过程复杂、目标产物得率较低,目标产物活性易丢失等问题[12]。目前,AFPs的分离纯化方法还仅限于实验室规模。因此,基于AFPs的特异性探索新的AFPs分离纯化方法已经成为AFPs研究的关键之一,尤其是具有高度专一性和选择性的亲和分离方法、材料的开发尤为重要。研究发现,特异性亲和吸附法具有提取效率高,目标产物的结构和活性改变小的特点[13-14]。本文在前期工作的基础上,搭建了特异性亲和吸附装置,以南极磷虾AFPs得率和THA为响应值,确定了特异性亲和吸附法提取南极磷虾AFPs的最佳条件,期望为南极磷虾AFPs的利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南极磷虾 由上海开创远洋渔业有限公司2014年11月于南极设得兰群岛海域捕获,冷藏运回国内,实验室于-80 ℃贮藏备用;所用试剂均为分析纯及以上级别。

PHS-3C型pH计 上海精密科学仪器有限公司;TGl-16M高速台式冷冻离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司;BM255C搅拌机 美的集团有限公司;电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;90-2型定时恒温磁力搅拌器 上海市沪西分析仪器有限公司;IMS-70型低温恒温槽 宁波天恒仪器厂;UV-2102PCS型紫外可见分光光度计 上海尤尼柯分析仪器有限公司;真空冷冻干燥机 LABCONCO FreeZone公司。

1.2 实验方法

1.2.1 南极磷虾蛋白质的制备 参考高飞等[15]方法提取南极磷虾蛋白质。

冷冻南极磷虾→室温解冻→匀浆→调节pH→离心→回收上清液→调节pH→离心→回收沉淀→调节pH至7.0→真空冷冻干燥→南极磷虾蛋白质(-80 ℃贮存)。

1.2.2 南极磷虾AFPs的提取及得率的计算 以南极磷虾蛋白质为原料提取南极磷虾AFPs,参照Kuiper等[13]方法构建特异性亲和吸附装置。该装置由“吸附装置”、隔热装置、磁力搅拌装置及可控温的恒温槽构成。实验前先将“吸附装置”置于预冷的双蒸水中,调节恒温槽的温度,降温至-1.6 ℃。将其放入预冷的南极磷虾蛋白质溶液中,通过调节恒温槽降温到所需要的温度;同时磁力搅拌器以较低的转速转动保持体系均匀,进行南极磷虾AFPs的分离纯化。南极磷虾AFPs提取结束后,将“吸附装置”上的冰部分用预冷的双蒸水冲洗,除去表面残留的南极磷虾蛋白质样品,使冰部分与“吸附装置”分离。将冰部分融化并保存进行下一步实验。

采用Bradford法测定南极磷虾AFPs的含量,以牛血清白蛋白为标准蛋白制作标准曲线并建立回归方程:y=0.6614x-0.0009(R2=0.9975);式中:y为样品中蛋白质含量,x为吸光度值;计算南极磷虾AFPs的得率。

1.2.3 南极磷虾AFPs热滞活性(THA)的测定 采用DSC法测定南极磷虾AFPs的THA。参照Ding等的方法并稍作改动[16]。将10 μL样品密封于铝坩埚中,放置在样品池中央,以空铝坩埚为对照。待设备运行稳定后,将体系温度降至-30 ℃直至完全冻结,保持5 min便于系统稳定。然后,以1.0 ℃/min的速度升温至20 ℃,样品的熔点和熔化的吸热面积被记录。样品的温度再被降至-30 ℃,保持5 min。然后以同样的速率缓慢升温至样品体系为固液混合物状态的温度,称为保留温度(Th)。重复上述过程。样品重结晶开始的温度(T0)和重新冻结的放热区域被记录。THA参照如下公式计算:

THA=Th-T0

1.2.4 单因素实验 在前期实验的基础上,分别考察了南极磷虾蛋白浓度(0.8、0.9、1.0、1.1 mg/mL),吸附温度(-1.7、-1.8、-1.9、-2.0 ℃),吸附时间(9、10、11、12 h),吸附次数(1、2、3、4次)等因素对南极磷虾AFPs得率及THA的影响,综合考察后确定较佳的提取条件并进行后续实验。

1.2.5 响应面实验 在单因素实验基础上,以南极磷虾蛋白质浓度、吸附温度、吸附时间和吸附次数为实验因素(自变量),以南极磷虾AFPs得率与其THA为评价指标(自变量),根据响应面法分别进行回归方程拟合及优化分析,确定实验条件下的最优提取工艺。采用Design Expert(8.0.5)处理所得数据。实验设计因素水平见表1。

表1 响应面分析因素与水平表
Table 1 Factors and levels in the response surface analysis

水平因素A样品浓度(mg/mL)B吸附温度(℃)C吸附时间(h)D吸附次数(次)-109-1791010-18102111-19113

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 样品浓度对南极磷虾AFPs得率及THA的影响 由图1可知,在样品浓度0.8 mg/mL时,AFPs得率较低;随着样品浓度的提高,AFPs得率也在上升;当样品浓度上升到1.0 mg/mL之后,AFPs得率趋于稳定。这可能是由于南极磷虾AFPs受冰晶吸附能力的限制,达到一定的吸附饱和度无法进一步提高吸附率。此外,研究还发现若样品浓度过高还可能造成非AFPs进入冰中,不仅浪费了样品,而且造成了AFPs得率的“升高”。从图1可以看出,THA随样品浓度的提高呈现先增加后下降的趋势,在样品浓度为1.0 mg/mL时THA最高;随着样品浓度从0.8 mg/mL提高到1.0 mg/mL时,吸附的AFPs量升高,THA相应的增大;但当样品浓度超过1.0 mg/mL后,THA呈现略微下降的趋势,这可能是由于样品浓度过高,少量非AFPs进入冰中,造成THA表观活性的降低。因此,综合考虑,确定样品的浓度为1.0 mg/mL较为合适。

图1 样品浓度对南极磷虾AFPs得率及THA的影响Fig.1 Effect of sample concentration on extraction yield and THA of Antarctic Krill AFPs

2.1.2 吸附温度对南极磷虾AFPs得率及THA的影响 由图2可知,随着吸附温度的降低,AFPs的THA呈现下降的趋势,且AFPs得率呈现先升高后下降的趋势,并在-1.8 ℃达到最高。如果这可能是由于体系的吸附温度过低,冰部分的生长过快,样品溶液冻结过快,溶液中的非AFPs被快速生长的冰晶 “俘获”冻结于冰中,导致所提取的AFPs中含有一定量的非AFPs,引起AFPs的THA降低[13]。因此,南极磷虾AFPs提取过程的吸附温度不宜过低。同时,若体系的吸附温度过高,冰的生长速度较慢,AFPs得率较低且耗时。因此,综合考虑,确定吸附温度选择-1.8 ℃较为合适。

图2 吸附温度对南极磷虾AFPs得率及THA的影响Fig.2 Effect of adsorption temperature on extraction yield and THA of Antarctic Krill AFPs

2.1.3 吸附时间对南极磷虾AFPs得率及THA的影响 由图3可知,当吸附时间为9 h时,南极磷虾AFPs得率为23.4%;当吸附时间为10 h后,南极磷虾AFPs得率为23.75%,得率提高了0.35%;当吸附时间从10 h到12 h,虽然时间延长了2 h,但是得率仅提高了约0.8%。这可能是因为样品中AFPs的含量是一定的,所以,AFPs的得率无法一直提高。当大部分的AFPs吸附到冰中以后,继续延长吸附时间,也不会对南极磷虾AFPs的得率产生显著影响。此外,吸附时间对THA的影响也不是很明显,THA活性大约稳定在0.07 ℃左右。因此,综合考虑,确定吸附时间10 h较为合适。

图3 吸附时间对南极磷虾AFPs得率及THA的影响Fig.3 Effect of adsorption time on extraction yield and THA of Antarctic Krill AFPs

2.1.4 吸附次数对南极磷虾AFPs得率及THA的影响 由图4可知,南极磷虾AFPs得率基本保持在22.5%左右,吸附次数对南极磷虾AFPs得率影响不显著。但吸附次数对于南极磷虾AFPs的THA影响较为显著,采用1次吸附提取后,THA最低为0.071 ℃;采用2次吸附提取后,THA上升为0.078 ℃,表明南极磷虾AFPs的纯度明显提高。但第3、4次吸附提取后,THA没有明显提高。因此,综合考虑,确定吸附次数为2次较合适。

图4 吸附次数对南极磷虾AFPs得率及THA的影响Fig.4 Effect of adsorption number on extraction yield and THA of Antarctic Krill AFPs

2.2 特异性亲和吸附法提取南极磷虾AFPs的条件优化

2.2.1 数学模型的建立 基于单因素实验结果确定了4个主要影响因素,以样品浓度、吸附温度、吸附时间和吸附次数为自变量,以南极磷虾AFPs得率与其THA为因变量,采用Design-Expert软件的Box-Behnken原理设计4因素3水平的响应面实验。结果见表2。

南极磷虾AFPs得率(Y1)自变量的回归方程:

Y1(%)=25.650+0.850A-0.096B+1.110C-0.023D+0.065AB-0.023AC-0.033AD+0.700BC-0.120BD+0.027CD-2.370A2+0.750B2+1.190C2+0.920D2

Y2=0.076+3.334×10-4A+7.292×10-4B+2.257×10-3C+1.000×10-3D-7.500×10-4AB+1.000×10-3AC-2.500×10-4AD+4.687×10-4BC+5.00×10-4BD+2.500×10-4CD-1.545×10-3A2-1.160×10-3B2+2.340×10-3C2-2.545×10-3D2

对该回归方程及各项系数分别进行方差分析、显著性检验,结果见表3。从表3中可以看出,回归模型均达到显著水平(p<0.01)。另外,模型的决定系数(R2)分别为0.9575和0.9457,均大于0.90,表明回归模型对数据的拟合程度较好[17-18]。回归模型的失拟性为不显著,该模型的稳定性也较好。因此,模型在特定条件下能够很好的预测自变量对响应值的影响。

表2 响应面实验设计与结果
Table 2 Design and results of the response surface methodology

实验号ABCD得率(Y1)THA(Y2)1-100-1234700702100-124770071300002556007640-1102821007850-1-10268700756001128960080700002539007580000253500769010-12746007210-1010248200771110-1024750074121-10025160073130101273600721400-1-1264700731511002421007416-1001231800731700-112637007518000025820077190-1012799007320101027050081210-1102717007922-10-10224300742300002614007624-1-100235600752510012461007326-11002287007327001-1289500772801-1026110075290-10-127620071

2.2.2 响应面分析 响应面图形是响应面Y对应用于因素A、B、C、D所构成的三维空间曲面图及在二维平面上的等高线图,可以直观地反映各因素和他们之间的交互作用对响应值的影响[19-20]。从表3中可以看出,以南极磷虾AFPs得率为响应值,2个一次项(样品浓度和吸附时间)和4个二次项达到显著水平(p<0.05)。因此,可以认为在考察范围内吸附温度和吸附次数对南极磷虾AFPs得率影响不显著。在其他因素条件不变的情况下,以BC为例考察交互项对南极磷虾AFPs得率的影响,结果见图5,由图可知,在样品浓度和吸附次数固定的条件下,在考察范围内,南极磷虾AFPs的得率随吸附时间的延长而逐渐增大,随吸附温度的升高先减小后增大。

图5 吸附时间与吸附温度对南极磷虾AFPs得率影响的响应面与等高线图Fig.5 Response surface plots and contour plots showing the effect of adsorption time and adsorption temperature on the extraction yield of Antarctic Krill AFPs

2.2.3 最佳条件的确定及验证实验 利用Design Expert 软件优化分析最佳实验条件为:样品浓度1.03 mg/mL,吸附温度-1.70 ℃,吸附时间为11 h,吸附次数为2.23次。在此最佳实验条件下,采用该模型预测南极磷虾AFPs的得率为29.34%,THA为0.0805 ℃。考虑到实际操作的可行性,确定样品的浓度为1.0 mg/mL,吸附温度为-1.70 ℃,吸附时间为11 h,吸附次数为2次。

表3 南极磷虾AFPs得率(Y1)回归模型的方差分析结果
Table 3 Analysis of variance of the regression model of the extraction yield(Y1)

方差来源平方和自由度均方F值p值显著性模型8611146152373<00001∗∗A871873358<00001∗∗B0099100990380546-C128E+011128E+014921<00001∗∗D608E-031608E-03002308805-AB001710017006508022-AC203E-031203E-03781E-0309308-AD423E-031423E-03001609002-BC142114254700347∗BD00551005502106515-CD303E-031303E-03001209155-A235541355413712<00001∗∗B2332133212820003∗∗C28481848327<00001∗∗D25421542209100004∗∗残差36314026失拟性265902915103383纯误差098502总离差897328

注:*p<0.05,影响显著;**p<0.01,影响非常显著。

为了验证响应面优化实验模型的可靠性,拟采用上述优化条件进行南极磷虾AFPs提取验证实验。经过实际测得南极磷虾AFPs的得率为30.12%,THA为0.079 ℃,与模型预测值之间的相对误差分别为2.66%和1.86%,说明响应面法优化获得的预测值与验证值较接近;表明该模型能够较好的预测南极磷虾AFPs的提取,进一步验证了回归模型的可靠性。

3 结论

本文以南极磷虾蛋白质为原料,采用特异性亲和吸附方法,通过单因素实验和响应面法对南极磷虾AFPs提取条件进行了优化,并建立了拟合度较好的数学模型。获得的较优提取条件为样品浓度1.0 mg/mL、吸附温度-1.70 ℃、吸附时间为11 h、吸附次数为2次;在此条件下,南极磷虾AFPs的预测得率为30.12%,THA为0.079 ℃;验证值与预测值之间的相对误差分别为2.66%和1.86%,表明该模型在特定范围内具有较好地预测效果,期望本文的结果能够丰富南极磷虾AFPs的研究。

[1]Ustun N S,Turhan S. Antifrezze proteins:Charactersitics,function,mechanism of action,sources and application to foods[J]. Journal of Food Processing and Preservation. 2015,39:3189-3197.

[2]Clarke C J,Buckley S L,Lindner N. Ice structuring proteins-a new name for antifreeze proteins[J]. Cryo-Letters,2002,23(2):89-92.

[3]DeVries A L,Wohlschlag D E. Freezing resistance in some Antarctic fishes[J].Science,1969,163(871):1073-1075.

[4]Stephen N,Jacqueline F,So K. The fishery for Antarctic krill-recent developments[J].Fish and fisheries,2012,13:30-40.

[5]Jaime F L,Raymond G,Mayzaud P.Elemental composition,biochemical composition and caloric value of Antarctic krill. Implications in energetics and carbon balances[J].Journal of Marine Systems,2009,78:518-524.

[6]Fields L G,DeVries A L.Variation in blood serum antifreeze activity of Antarctic Trematomus fishes across habitat temperature and depth[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part A:Molecular & Integrative Physiology,2015,185:43-50.

[7]刘志东,曲映红,王媛,等. 南极磷虾生物活性物质的研究进展[J].天然产物研究与开发,2012,24(10):1491-1495.

[8]汪少芸,赵立娜,周焱富,等.食源性明胶多肽的制备、分离及其抗冻活性[J].食品科学,2013,34(9):135-139.

[9]金周筠,刘宝林.小麦麸皮抗冻蛋白的纯化及理化性质的研究[J].食品工业科技,2015(20):159-163,174.

[10]金涛,张英,任玮,等.真空渗透离心法提取燕麦抗冻蛋白工艺的研究[J].食品工业科技,2012(23):267-271.

[11]Mizrahy O,Bar-Dolev M,Guy S,et al. Inhibition of ice growth and recrystallization by zirconium acetate and zirconium acetate hydroxide[J].PLoS One,2013,8(3):1-9.

[12]徐化能,马淑凤,张连富.植物抗冻蛋白分离纯化方法的研究进展[J].食品与生物技术学报,2013,04:347-352.

[13]Kuiper M J,Lankin C,Gauthier S Y,et al. Purification of antifreeze proteins by adsorption to Ice[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2003,300(3):645-648.

[14]阮功成,曹慧,徐斐,等.特异性亲和吸附装置对胶原抗冻肽的分离纯化[J].食品与发酵工业,2015(9):19-23.

[15]高飞,韩春然,石彦国,等.南极磷虾蛋白质提取条件优化[J].天然产物研究与开发,2016(2):307-312,194.

[16]Ding X L,Zhang H,Liu W,et al. Extraction of carrot(Daucus carota)antifreeze proteins and evaluation of their effects on frozen white salted noodles[J].Food and Bioprocess Technology,2014,7(3):842-852.

[17]金周筠,刘宝林. 小麦麸皮抗冻蛋白提取的关键因素及其优化[J].中国粮油学报,2015,30(4):44-49.

[18]夏露,张超,王立,等. 冬小麦抗冻蛋白制备及其在汤圆中的应用研究[J]. 食品工业科技,2009(11):241-243.

[19]Liu C L,Lin T H,Juang R S.Optimization of recombinant hexaoligochitin-producing chitinase production with response surface methodology[J].Carbohydrate Polymers,2013,62(10):518-522.

[20]Ghorbel B O,Hajji S,Younes I,et al. Optimization of chitin extraction from shrimp waste with Bacillus pumilus A1 using response surface methodology[J]. International journal of biological macromolecules,2013,61(2):243-250.

Extraction of the antifreeze proteins from Antarctic Krill (Euphausia superba)by specific affinity adsorption

MA Qing-bao1,2,CHEN Xue-zhong1,LIU Zhi-dong1,*,QU Ying-hong2,WANG Yi-hong1,WANG Shuai1,2

(1.East China Sea Fisheries Research Institute,ChineseAcademy of Fishery Sciences. Shanghai 200090,China; 2.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

In this paper,the key factors and optimal conditions of extraction of Antarctic Krill AFPs(Antifreeze proteins,AFPs)were researched by specific affinity adsorption. On the basis of single factor experiment,sample concentration,adsorption temperature,adsorption time and adsorption number were optimized by response surface methodology with the AFPs extraction yield and THA as response value. The results indicated that the optimal extraction process was sample concentration of 1.0 mg/mL,adsorption temperature of-1.70 ℃,adsorption time of 11 h,the adsorption number of 2. Under the optimal conditions,the model optimum solution would be 29.34% and 0.0805 ℃. The relative errors were 2.66% and 1.86% between actual and model value. The fitted mathematical models for the extraction yield of Antarctic Krill AFPs and its THA had a good feasibility.

Antarctic krill;antifreeze protein;specific affinity adsorption;response surface methodology;optimization

2016-06-23

马庆保(1991-)，男，在读硕士研究生，研究方向：海洋生物资源利用研究，E-mail：zd-liu@hotmail.com。

*通讯作者:刘志东(1976-)，男，博士，副研究员，研究方向：海洋生物资源利用研究，E-mail：zdliu1976@163.com。

上海市自然科学基金(13ZR1449900)；国家自然科学基金(31471687)；上海市科技兴农项目(沪农科攻字(2015)第5-5号)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金 (2016HY-ZD0903)。

TS254.1

B

1002-0306(2016)23-0183-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.026