曼氏迭宫绦虫钙/钙调素依赖蛋白激酶I (SmCaMK I)基因的生物信息学分析与表达鉴定

李奕基，陈新新，符瑞佳，陈小静，吕 刚，梁 培,3

曼氏迭宫绦虫钙/钙调素依赖蛋白激酶I (SmCaMK I)基因的生物信息学分析与表达鉴定

李奕基1,2，陈新新2，符瑞佳1,2，陈小静2，吕 刚1,2，梁 培1,2,3

目的 开展SmCaMK I(曼氏迭宫绦虫钙/钙调素依赖蛋白激酶I)的潜在生物学特征分析和功能研究。方法利用相关网站和软件对SmCaMK I的同源性核苷酸序列比对分析、保守位点预测、构建分子进化树、编码氨基酸的淋巴细胞表位进行分析预测。此外，SmCaMK I进行扩增，并克隆到表达载体pET-28α(+)中进行蛋白的表达纯化，制备大鼠免疫血清进行虫体免疫组织定位分析。结果SmCaMK I是一个全长基因，由1 068 bp组成，编码355个氨基酸。SmCaMK I与细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫的CaMK I保守功能域的氨基酸序列一致性分别为89%和88%，与人的CaMK I氨基酸序列一致性仅仅只有44%。分子进化树分析中SmCaMK I与绦虫属的亲缘关系最近，与其他物种亲缘性较远。与人类CaMK I相比，淋巴细胞表位具有统计学差异。SmCaMK I能够定位在成虫的睾丸和虫卵，在裂头蚴中大量表达和特异定位于体表。结论SmCaMK I是参与虫体生长发育繁殖的重要蛋白分子，还可能是一个潜在的疫苗靶标蛋白。

曼氏迭宫绦虫；SmCaMK I；生物信息学分析；原核表达；免疫组织化学定位

曼氏迭宫绦虫(Spirometramansoni)属于绦虫纲、假叶目、迭宫属。曼氏迭宫绦虫成虫主要寄生于猫科动物体内，偶有寄生于人体，但是其中期裂头蚴可在人体寄生，导致曼氏裂头蚴病，其危害远大于成虫[1]。1882年Manson首次在我国厦门的一具男尸中检出曼氏裂头蚴，之后世界各地相继有病例报告。曼氏裂头蚴病多见于东亚和东南亚各国，欧洲、美洲、非洲和澳洲也有记录[2]。目前在我国已有1 000多例病例，分别来自27个省、市、自治区[3]。感染者年龄为未满周岁～62岁，以10～30岁感染率最高，各民族均有[4-5]。

人感染裂头蚴的主要途径有局部敷贴生蛙肉、吞食生的或未煮熟的蛙肉/蛇肉、误食感染的剑水蚤[6]。曼氏裂头蚴可寄生于人体全身部位，可在体内移行，寄生部位多变，其中以寄生在眼部与大脑最为危险，严重可导致失明、残疾甚至危及生命。此外，曼氏裂头蚴临床表现各不相同，由于缺乏特异性表现，误诊、漏诊现象较为普遍[7]。目前，临床上也缺乏预防裂头蚴感染的特异性疫苗。

钙/钙调素依赖蛋白激酶(Calcium/Calmodulin-dependent protein kinase, CaMK)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族中一员[8]。CaMK具有相似的-N端催化域(CaMKⅡ除外)和具有自身抑制功能的-C端调节域，在与Ca2+/CaM结合之前，激酶保持在一个抑制状态，在两者结合后被激活[9]。钙/钙调素依赖蛋白激酶I (Calcium/Calmodulin-dependent protein kinase I, CaMK I)有4种亚基(α、β、γ、δ)，分子量在38～42 kDa之间，几乎在所有细胞当中表达[10]。Skelding等人发现，CaMK I参与细胞周期的G1期，并对细胞周期与细胞增殖的调节有着非常重要的影响[11]。CaMK I含有丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)磷酸化位点，能使许多细胞内底物磷酸化，从而诱发一系列的作用，如受精[12]、成骨细胞分化[13]、维持血管张力[14]、神经突触增生[15]、免疫和炎症反应[16]、醛固酮的合成于释放[17]、对细胞周期的调控[18]等。姚利晓等人发现一种日本血吸虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其免疫血清具有免疫保护作用，能有效的杀伤日本血吸虫童虫，影响童虫发育[19]。

因此，我们推测SmCaMK I可能对于曼氏迭宫绦虫的生长发育有着重要的作用，为此，本次实验通过进行SmCaMK I的生物信息学的分析、基因克隆和获得蛋白以及其在虫体中的组织定位分析，为进一步研究SmCaMK I在曼氏迭宫绦虫生长发育、免疫逃避和疫苗研发等奠定物质基础和提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 曼氏迭宫绦虫CaMK I全长序列、pET-28α(+)质粒全长为5 369 bp，是两端均带有His标签的原核表达质粒，含有卡那霉素抗性基因，均由海南医学院热带医学与检验医学院寄生虫教研室基因组文库提供。大肠杆菌DH5α、BL21(DE)、PCR Mix、DL2000、DL15000、质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自天根生化技术有限公司；EcoR I限制性核酸内切酶、XolI限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶，蛋白质Marker、预染蛋白Marker购自Thermo Fisher Scientific公司；Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)、Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Rat IgG(H+L)购自美国proteintech公司；His-Tag Mouse monoclonal antibody、Cy3标记的山羊抗小鼠IgG (H+L)购自碧云天生物科技有限公司；增强型DAB显色试剂盒购自北京索来宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1SmCaMK I基因的识别 曼氏迭宫绦虫成虫cDNA文库中EST克隆GDTC009_E09通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)BLASTx程序，将基因的编码氨基酸序列与GenBank中其他物种的同源氨基酸序列进行比对，推测该基因的功能，判断其是否为全长基因。

1.2.2SmCaMK I氨基酸序列生物信息学分析

1.2.2.1 利用蛋白分析系统Expasy(http://www.expasy.org/)对蛋白的理化性质和功能域进行分析。

1.2.2.2 利用(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站下载不同物种的同源蛋白，使用MEGA5.0软件构建系统进化树。

1.2.2.3 使用BepiPred和NetTepi在线软件对蛋白的淋巴细胞表位进行预测分析。

1.2.3SmCaMK I基因克隆 以曼氏迭宫绦虫成虫文库质粒作为模板，利用PCR的方法进行扩增，特异性引物通过Primer Premier 5.0 和 PCRDESIGN软件进行设计，上游和下游引物分别是5′-GACGAATTCATGAGTCGCAAAACACCT-3′ (EcoR I)；5′-GACCTCGAGTCACACTTCAGGATTTAC-3′(XhoI)。扩增的反应条件如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35循环，72 ℃稳定10 min。将PCR产物进行纯化，利用相同的限制性内切酶进行酶切并与预先酶切好的原核表达载体pET-28α(+)进行连接。将连接产物转入到大肠埃希菌DH5α中，挑取阳性克隆，进行增菌，提取重组质粒进行双酶切鉴定和测序验证。

1.2.4SmCaMK I蛋白表达 将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21中，进行IPTG诱导，8 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃去上清液。在沉淀中加入5 mmol/L咪唑，使用超声裂解法裂解细胞，12 000 r/min， 4 ℃离心10 min，弃去上清。在沉淀中依次加入0.5 mol/L、1 mol/L、2 mol/L、4 mol/L、6 mol/L、8 mol/L尿素溶液重悬混匀，12 000 r/min，4 ℃离心10 min，分别收集上清液并做好标记。上清液进行12%SDS-PAGE验证，选取出目的蛋白含量最多的溶液进行蛋白纯化。将得到的上清液进行梯度递减透析尿素，然后利用0.45 μm滤膜过滤，根据His柱蛋白纯化说明书进行蛋白纯化。

1.2.5SmCaMK I免疫大鼠血清制备 将纯化得到的SmCaMK I蛋白和佐剂(1∶1)混合进行乳化，免疫SD大鼠。其中初次免疫是用不完全佐剂，之后的3次加强免疫是用完全佐剂。每两周免疫一次，在免疫后的第8周取血，利用ELISA检测血清滴度。

1.2.6SmCaMK I的Western Blot鉴定 将纯化蛋白进行12%SDS-PAGE跑胶，100V，冰水中电泳1 h左右，转膜。5%脱脂奶粉常温封闭2 h。利用PBST进行洗膜，孵育一抗 (His-Tag小鼠血清，1∶1 000；免疫大鼠血清，1∶400)，4 ℃过夜。洗涤之后，分别孵育大小鼠二抗(1∶5 000)，洗涤，然后进行DAB显色，按照试剂盒进行显色，出现条带后放入去离子水中以终止反应。

1.2.7SmCaMK I虫体免疫组织化学定位 将收集曼氏迭宫绦虫成虫和裂头蚴分别用4%多聚甲醛固定后，进行石蜡包埋。将包埋的裂头蚴和成虫切片，厚度约4～5 μm(海南医学院附属医院病理科完成)，切片50 ℃烘干后存于-20 ℃备用。将切片室温平衡30 min后，60 ℃烤箱烤片40 min。于二甲苯中进行脱蜡，用梯度酒精逐级水化，洗涤。放入枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)，水浴自然升温至95 ℃，保温20 min后自然冷却至室温进行抗原修复。洗涤后进行正常山羊血清室温封闭2 h，PBST冲洗。在切片上滴加200 μL稀释的重组蛋白免疫小鼠血清(1∶200稀释，稀释液为1%BSA-PBS)，用免疫前的正常小鼠血清作阴性对照，置于湿盒内4 ℃孵育过夜。次日，洗涤。每张切片加200 μL的红色荧光Cy3标记的山羊抗小鼠IgG (H+L)(1∶400稀释)，室温下湿盒内孵育2 h，洗涤。切片加200 μL组织自发荧光淬灭剂，室温避光静置15 min，洗涤之后，荧光显微镜下观察并拍照。

2 结 果

2.1 蛋白编码氨基酸序列中功能位点分析 通过同源氨基酸的比对分析，该基因具有完整的编码阅读框，并且属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族蛋白。采用NCBI的BLAST对SmCaMK I的结构功能域进行分析，发现SmCaMK I有4个活性位点分别为活性位点、ATP 结合位点、多肽底物结合位点、激活环。分别将细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus，EUB632702.1)、多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis，CDS40668.1)、人(Homosapiens，NP_003647.1)功能域的氨基酸与SmCaMK I功能域的氨基酸序列进行比对发现序列一致性为89%、88%、44%。

2.2 系统进化树 采用MEGA5.0基于NJ法构建系统进化树，将曼氏迭宫绦虫、细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、麝猫后睾吸虫(Opisthorchisviverrini，XP_009163606.1)、华支睾吸虫(Clonorchissinensis，GAA29101.1)、微小膜壳绦虫(Hymenolepismicrostoma，CDS32035.1)、家兔(Oryctolaguscuniculus，XP_008248543.1)、大鼠(Rattusnorvegicus，NP_878262.1)、小鼠(Musmusculus，NP_659066.1)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis，XP_008248543.1)、人(Homosapiens，NP_003647.1)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus，EAL93663.1)的CaMK I氨基酸序列构建系统进化树。结果如图1所示，同属于绦虫类SmCaMK I与细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的CaMK I同源序列属于同一进化分支，证明其亲缘关系最接近；而与人类、鼠类、原核生物分布于不同的分支，在进化上说明亲缘关系较远。

图1 SmCaMK I同源氨基酸序列构建系统进化树Fig.1 The evolution tree of SmCaMK I

2.3 淋巴细胞表位分析 利用BepiPred、NetTepi软件分析对该蛋白质编码的氨基酸序列的表位进行分析，发现SmCaMK I可能有10个潜在的B淋巴细胞抗原表位(aa1-aa17、aa57-aa72、aa129-aa135、aa153-aa161、aa166-aa171、aa195-aa199、aa209-aa219、aa236-aa246、aa262-aa268、aa350-aa355)和5个T淋巴细胞表位(77aa-85aa、93a-101aa、173aa-181aa、188aa-196aa、327aa-335aa)。将SmCaMK I与人类CaMK I抗原表位进行对比发现，B细胞表位重合率较高，但是对应的编码氨基酸差异较大，并且T淋巴细胞表位存在统计学差异，如图2和图3所示。

图2 B淋巴细胞表位比对Fig.2 The alignment of B lymphocyte epitopes

图3 T淋巴细胞表位比对Fig.3 The alignment of T lymphocyte epitopes

2.4SmCaMK I基因的扩增和克隆 利用特异性引物，从曼氏迭宫绦虫成虫cDNA文库中扩增出SmCaMK I基因，经琼脂糖凝胶电泳检测在1 000 bp附近有特异性条带。根据生物信息学分析ORF Finder分析此基因编码区为1 068 bp，说明扩增产物与理论值大小基本符合。将提取的重组质粒使用限制性内切酶EcoR I和XhoI进行双酶切，分别获得的基因片段在1 000 bp和5 000 bp附近，如图4。测序结果表明插入序列与SmCaMK I基因序列一致，上述结果说明重组原核表达质粒构建成功。

M1:DL2 000 DNA Marker；1:SmCaMK I基因；2:pET-28α空质粒；3:pET-28α(+)-SmCaMK I重组质粒；4:pET-28α(+)-SmCaMK I重组质粒双酶切；M2:DL15 000 DNA MarkerM1: DL2 000 DNA Marker; 1: SmCaMK I gene; 2: pET-28a(+) plasmid; 3: pET-28a(+) SmCaMK I recombinant plasmid; 4: pET-28a(+) SmCaMK I recombinant plasmid was digested by double enzyme; M2: DL15 000 DNA Marker图4 重组质粒pET-28α(+)-SmCaMK I的PCR及酶切鉴定图Fig.4 The identification of the pET-28α(+)-SmCaMK I by PCR amplification and digestion with restriction enzymes

M:蛋白Marker；1:大肠杆菌空载未诱导；2:大肠杆菌空载诱导；3:大肠杆菌重组质粒未诱导；4:大肠杆菌重组质粒诱导；5:诱导后菌液上清；6:诱导后菌液沉淀；7:纯化蛋白。M:Protein molecular weight markers, lysate of E.coli with pET-28a(+) vector before induction (lane 1) and after induction (lane 2), lysate of E.coli with pET-28a(+)-SmCaMK I before induction (lane 3) and after induction (lane 4), supernatant (lane 5) and precipitant (lane 6) of lysate of E.coli with pET28a(+)-SmCaMK I after induction, and the purified recombinant SmCaMK I protein (lane 7).图5 SmCaMK I蛋白的表达和纯化的12%SDS-PAGE电泳分析Fig.5 Analysis 12%SDS-PAGE of protein expression and purification of SmCaMK I

2.5 蛋白表达及纯化 将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中进行表达，12%SDS-PAGE电泳分析结果如图5所示，在45 kDa附近有表达条带，与目的蛋白分子量44.13 kDa基本相符合。蛋白进行纯化，得到的纯化蛋白条带位置与预测分子量相符。2.6SmCaMK I的western blot鉴定 图6显示，纯化蛋白能被His单克隆抗体识别，且能与大鼠免疫血清特异性反应，识别条带均在40～55 kDa之间，与预测分子量相符合。

A为His单克隆抗体识别；B为SmCaMK I蛋白免疫大鼠的免疫血清识别。A:rSmCaMK I protein was probed by anti-His-tag mouse serum (A) and anti-rSmCaMK I rat serum (B).图6 SmCaMK I蛋白的His识别和抗原性鉴定Fig.6 His Tag and anti-SmCaMK I rat serum identification of SmCaMK I

2.7SmCaMK I在虫体中组织定位SmCaMK I能够定位在成虫的睾丸和虫卵，如图7；在裂头蚴阶段，整个虫体发出荧光和特异定位于体表，如图8。

3 讨 论

CaMK I广泛存在于各组织的细胞中，作为一个细胞内级联反应的信号分子[20]，其对于下游靶酶的磷酸化和对细胞周期的调控起着重要的作用，主要在细胞中参与信号转导和调控细胞增殖。有研究表明使用CaMK抑制剂能抑制分裂间期DNA的复制[21]。CaMK证实是细胞周期过程的介导因子，其中CaMK I是G1期重要的调节因子[22]。钙离子是普遍存在的第二信使，在许多生物体和参与众多的生理过程[23]。在细胞内游离的钙离子的变化是一种常见的信号转导，CaMK I是参与介导钙离子来发挥作用的[24]。在克氏锥虫研究中发现，CaMK参与调节寄生虫繁殖所需的血红蛋白诱导的细胞信号通路[25]。

通过完整编码阅读框的预测，得知SmCaMK I是一个全长基因，根据保守功能域得知其编码氨基酸序列中存在4个活性位点，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白家族。将编码的氨基酸序列进行蛋白理化性质预测得知，蛋白质理论等电点9.35，理论分子量44.13 kDa。氨基酸溶剂可及性和亲疏水性发现，编码SmCaMK I的氨基酸有44.79%包埋在蛋白内部，55.21%暴露在溶液界面，不稳定系数39.47，脂肪系数90.11，亲水指数-0.416，说明SmCaMK I是一个稳定的疏水蛋白。在后续的蛋白表达过程中发现，经过IPTG诱导表达，目的蛋白主要在细胞沉淀物中存在，上清中蛋白含量极低，该结果与预测结果相符，纯化蛋白的12%SDS-PAGE条带显示分子量大小与预测值相吻合。

SmCaMK I编码的功能位点氨基酸序列比对中发现曼氏迭宫绦虫与细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫的CaMK I的编码氨基酸序列一致性均达到88%以上，可能是因为同属于扁形动物门的绦虫纲[1]。然而与人类的CaMK I一致性仅仅只有44%。此外，在构建的系统进化树中，我们发现寄生虫和哺乳动物、微生物属于不同的分支，曼氏迭宫绦虫与其他绦虫如细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫同属一个分支，亲缘关系最近，而与人类的亲缘性相对较远，这一结果与氨基酸比对分析结果一致。通过淋巴细胞表位预测发现SmCaMK I与人类的CaMK I序列中B淋巴细胞表位重合率较高，但是重合部分氨基酸序列差异较大，并且T淋巴细胞表位对比中发现两者表位分布具有显著性差异且发现表位153aa-161aa空间位置与SmCaMK I功能位点重合。将纯化蛋白进行免疫大鼠制备免疫血清，通过血清滴度测定显示出较高的滴度，说明SmCaMK I具有良好的免疫原性。此外，Western Blotting结果显示该蛋白具有良好的免疫反应性。这些结果充分说明了SmCaMK I是一个非常有研究价值的疫苗候选分子。

A&B成虫在白光下拍照；C&D分别是免疫大鼠血清识别和正常大鼠血清识别的荧光下拍照，放大倍数为20x，T:睾丸；E：虫卵。A&B were corresponding to bright fields at adult worms stage; C&D were respectively treated with anti-rSmCaMK I rat serum and naïve rat serum in the fluorescent light. The images were magnified at 20x. T: testicle; E: eggs图7 SmCaMK I在成虫组织中的定位Fig.7 Immunohistochemical localization of SmCaMK I in adult worm

A&B成虫白光；C&D分别是免疫大鼠血清识别的荧光和正常大鼠血清识别的荧光下拍照，放大倍数为20x，t:体表。A&B were corresponding to bright fields at sparganum stage; C&D were respectively treated with anti-rSmCaMK I rat serum and naïve rat serum in the fluorescent light. The images were magnified at 20x. t: tegument图8 SmCaMK I在裂头蚴组织中的定位Fig.8 Immunohistochemical localization of SmCaMK I in sparganum

在虫体免疫组织化学定位中，SmCaMK I能够在成虫的生殖器官睾丸和虫卵中大量表达，尤其在虫卵中，能够在卵壳上有特异性的定位，这些器官都是虫体生长发育繁殖后代的主要部位。CaMK I是参与CaM介导的细胞内Ca2+信号传导。在曼氏裂体吸虫研究中发现，钙离子能够通过调节卵壳合成材料来参与虫卵的形成[26-27]，并且还有研究发现曼氏裂体吸虫的CaM免疫感染寄生虫的小鼠，能够显著减少虫卵数量[28]。另外，CaMK I属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员。姚利晓等人在东方田鼠血清中发现日本血吸虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抗体在杀伤日本血吸虫中具有重要作用，并且能有效抑制该酶活性，破坏生物体内正常的磷酸化以及去磷酸化的过程，从而干扰日本血吸虫童虫的生长发育[19]，这些实验结果都充分地证明了SmCaMK I可能在虫体生长过程中发挥非常重要的作用。此外，还意外发现，SmCaMK I能够在裂头蚴虫体内大量表达，还特异定位在体表，寄生虫体表是一个非常重要的部位，是参与虫体吸收营养、排泄代谢产物、释放保护因子。此外，虫体体表还是直接接触宿主的部位，也是寄生虫产生免疫逃避的部位。CaMK I之所以能够定位在体表可能是因为调节Ca2+离子，来参与了寄生虫肌肉和体表的运动。许多的研究证实了，虫体体表蛋白是一个很好的疫苗候选分子[29]。这进一步证实了，SmCaMK I为今后开发疫苗提供夯实的理论依据。

综上所述，SmCaMK I不仅是一个参与信号传导的重要蛋白，还是一个参与虫体生长发育繁殖的因子，并且还可能是一个潜在的疫苗靶标蛋白。

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Sequence bioinformatics analysis, expression and identification of Calcium/ Calmodulin-dependent protein kinase I (CaMK I) fromSpirometramansoni

LI Yi-ji1,2, CHEN Xin-xin2, FU Rui-jia1,2, CHEN Xiao-jing2, LYU Gang1,2, LIANG Pei1,2,3

(1.KeyLaboratoryofTranslationalMedicineforTropicalDiseases,MinistryofEducation,HainanMedicalUniversity,Haikou571199,China;2.SchoolofTropicalMedicineandLaboratoryMedicine,HainanMedicalUniversity,Haikou571199,China;3.CollegeofAgriculture,HainanUniversity,Haikou570228,China)

The aim for this study is predicting the biological characteristics and potential functions of Calcium/calmodulin dependent protein kinase I (CaMK I) fromSpirometramansoni(SmCaMK I), and cloning it into prokaryotic expression vector, as well as performing immunohistochemical localization, which paved the way for the further study. The nucleotide sequence homology analysis, the conserved sites prediction the physical and chemical parameters and the lymphocyte epitope ofSmCaMK I were performed by NCBI website and online software. The evolution tree was built by MEGA5.0 software. In addition, the CaMK I genes was amplified and cloned into the expression vector pET-28α(+). The protein was expressed and purified, as well as used to prepared for anti-rSmCaMK I rat serum, which was used to perform immunohistochemical localization in parasites.SmCaMK I was a full length gene, composed of 1 068 bp and encoded 355 amino acids. What's more, the deduced amino acid sequence shared above 88% identities withEchinococcusgranulosusandEchinococcusmultilocularis, but 44% identity withHomosapiens. The analysis of system evolution tree showed that the genetic relationship betweenSmCaMK I was the closest and CaMK I from Taenia and far from other species. The lymphocyte epitope prediction showed obviously different betweenSmCaMK I and CaMK I ofHomosapiens. The western Blot results indicate thatSmCaMK I has great immunogenicity. Immunohistochemical localization detection showed thatSmCaMK I was expressed in the testis and eggs of adult worms, and also extensive distributed in tissue and tegument of sparganum. The study indicated thatSmCaMK I is a critical protein involving in parasite's growth and reproduction, and may be a potential vaccine target protein.

Spirometramansoni;SmCaMK I; bioinformatics analysis; prokaryotic expression; immunohistochemical localization

Liang Pei, Email: liangpeilp2012@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.002

国家自然科学基金(No.81560332&No.81260254)和海南省自然科学基金(No.814289)联合资助

梁 培，Email：liangpeilp2012@163.com

1.海南医学院热带病转化医学教育部重点实验室，海口 571199； 2.海南医学院热带医学与检验医学院，海口 571199； 3.海南大学农学院，海口 570228

R383

A

1002-2694(2016)12-1044-07

2016-07-20；

2016-10-19

Supported by the Natural Science Foundation of China (No. 81560332 & No. 81260254),and the Natural Science Foundation of Hainan Province (No. 814289)