通腑益气汤对脓毒症模型大鼠TNF-α、IL-lβ 及ICAM-1水平的影响

赖志珍 季春莲 许秀娟 孟建标 张 薇 胡马洪

·论著·

通腑益气汤对脓毒症模型大鼠TNF-α、IL-lβ 及ICAM-1水平的影响

赖志珍 季春莲 许秀娟 孟建标 张 薇 胡马洪

目的观察通腑益气汤对脓毒症模型大鼠血清TNF-α、IL-lβ及ICAM-1水平影响和肠组织的病理改变。方法将雄性SD大鼠按随机数字表法分为模型组、氧氟沙星组、通腑益气汤组，每组12只。采用经典盲肠结扎穿孔法（CLP）制备大鼠脓毒症模型，氧氟沙星组采用灌胃氧氟沙星16mg/kg，通腑益气汤组在此基础上给予通腑益气汤水煎剂（含生药1g/mL）灌胃，每天1次，连续3天，模型组用等量生理盐水灌胃。检测各组大鼠血清TNF-α、IL-lβ及ICAM-1水平和光学显微镜下观察肠组织病理改变并进行评分。结果模型组大鼠血清TNF-α、IL-lβ及ICAM-1分别为（95.26±34.73）ng/mL、（30.83±12.32）pg/mL、（914.72±82.13）pg/mL，氧氟沙星组分别为（78.46±30.24）ng/mL、（24.72±10.53）pg/mL、（790.69±60.24）pg/mL，通腑益气汤组分别为（60.38±21.81）ng/mL、（19.31±8.62）pg/mL、（681.69±52.62）pg/mL，与模型组和氧氟沙星组比较，通腑益气汤组大鼠血清TNF-α、IL-lβ、ICAM-1水平明显降低（P＜0.05）；模型组、氧氟沙星组、通腑益气汤组肠组织损伤评分分别为（4.21±0.61）分、（3.56±0.32）分、（2.84±0.27）分，与模型组和氧氟沙星组比较，通腑益气汤组肠组织损伤病理学评分最低（P＜0.05）。结论通腑益气汤对脓毒症模型大鼠肠黏膜的保护作用可能与其抑制TNF-α、IL-1β过度表达，进而下调ICAM-1水平有关。

大鼠；脓毒症；TNF-α；IL-lβ；ICAM-1；肠损伤；通腑益气汤

KEY WORDSrats;sepsis;TNF-α;IL-lβ;ICAM-1;intestinal injury;Tongfu Yiqi decoction

脓毒症（sepsis）是由感染引起的全身炎性反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），可发展为严重脓毒症、脓毒症休克及多脏器功能衰竭[1]。西医对阻断脓毒症的病理发展过程尚缺乏有效的治疗方法，中医药治疗脓毒症有着广泛的前景，这在近期中国脓毒症中西医结合诊治专家共识指南中有体现[2]。通腑益气汤是我科在长期临床实践中总结出的治疗脓毒症合并胃肠功能障碍的经验方。本研究拟观察通腑益气汤对脓毒症模型大鼠血TNF-α、IL-lβ及ICAM-1水平的影响，并观察肠黏膜的病理改变，探讨其抑制炎症反应的作用。

1 实验材料

1.1 动 物 健康SPF级雄性SD大鼠36只，体质量（300±20）g，购于浙江省实验动物中心，合格证号：SCXK（浙）2014-0001，置于室温21℃，相对湿度30% ～70%，自然光照和基础饲料喂养。

1.2 药 物 大黄（后下）10g，芒硝6g，厚朴、枳实各10g，黄芪20g，当归12g。加水浓煎制成汤剂68mL，过滤除菌分装-20℃保存备用，含生药1g/mL。

1.3 试剂和仪器 氧氟沙星胶囊（批号W026，永信药品工业有限公司）；生理盐水（批号41203274，杭州民生药业有限公司）；静脉输液针（批号111230，圣光医用制品有限公司）；密闭式静脉留置针（苏州碧迪医疗器械有限公司）。TNF-α、IL-lβ及 ICAM-1 ELISA试剂盒均为美国Endogen公司原装产品，由深圳晶美生物有限公司上海分公司提供，酶标仪ELX808系美国Biotek公司产品。

2 实验方法

2.1 造模及分组 动物实验经浙江省医学实验动物管理委员会同意。将36只雄性清洁级SD大鼠按随机数字表法分为模型组、氧氟沙星组、通腑益气汤组，每组12只。参照文献[3]报道的盲肠结扎穿孔法（CLP）制备脓毒症大鼠模型，术毕给予动物皮下注射生理盐水10mL/kg以补充术中液体丢失。CLP是诱发脓毒症的经典方法，其不仅可以通过穿孔处溢出的粪便进入腹腔，引起混合感染，同时结扎后的盲肠可因缺血坏死，释放炎症因子，诱发脓毒症。本研究脓毒症模型大鼠5天后开始出现死亡，9天存活率为零，证明模型制备成功。

2.2 给 药 通腑益气汤组在造模6h后给予10mL/kg的通腑益气汤和16mg/kg的氧氟沙星灌胃，1天1次，直至造模后第3天；氧氟沙星组在造模6h后给予每天灌胃16mg/kg的氧氟沙星及10mL/kg生理盐水，模型组于相同时间点给予等量生理盐水灌胃。

2.3 标本采集与检测

2.3.1 各组血清TNF-α、IL-lβ及ICAM-1水平 于第4天给予10%水合氯醛（0.3mg/100g）腹腔内注射麻醉，取大鼠单侧颈总动、静脉血，3000r/min,离心15min，分离提取血清后置-67℃低温冰箱保存待测。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清TNF-α、IL-lβ、ICAM-1）水平。严格按照说明书进行。

2.3.2 光镜下观察各组肠黏膜病理 于第4天留取血标本后处死大鼠，取距肛门5cm处肠黏膜30～50mg组织分别置于4%甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片、HE染色后，光镜下观察。先由两位病理科医师在不了解动物实验分组的情况下按Chiu等[4]的方法进行肠组织损伤评分，以0～5分表示不同的损伤级别。评分标准：0分：肠黏膜绒毛正常；1分：绒毛顶端上皮下出现囊状间隙，并伴有毛细血管充血；2分：上皮下间隙扩大,固有层中度水肿，中央乳糜管扩张；3分：固有层明显水肿，肠黏膜上皮层细胞变性、坏死，少数绒毛顶端脱落；4分：上皮层细胞变性、坏死、脱落，部分绒毛脱落,固有层裸露，毛细血管扩张、充血；5分:绒毛脱落、固有层崩解,出血或溃疡形成。

3 实验结果

3.1 各组大鼠血清TNF-α、IL-lβ及ICAM-1水平比较 与氧氟沙星组和模型组比较，通腑益气汤组血清TNF-α、IL-lβ、ICAM-1水平均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-lβ及ICAM-1水平比较（±s）

表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-lβ及ICAM-1水平比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与氧氟沙星组比较，▲P＜0.05

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3.2 各组大鼠肠组织损伤评分比较 与氧氟沙星组和模型组比较，通腑益气汤组大鼠肠组织损伤病理学评分最低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。各组大鼠肠黏膜病理改变结果见插页图1。

表2 各组大鼠肠组织损伤评分比较（±s）

表2 各组大鼠肠组织损伤评分比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与氧氟沙星组比较，▲P＜0.05

组别模型组氧氟沙星组通腑益气汤组鼠数12 12 12肠组织损伤评分（分）4.21±0.61 3.56±0.32* 2.84±0.27*▲

4 讨论

脓毒症的发病机制极为复杂，其中免疫炎症反应紊乱是重要的发病机制之一。脓毒症的免疫炎症反应紊乱源于机体促炎抗炎机制失衡，在脓毒症早期，促炎因子（如TNF-α、IL-lβ）占优势而表现为一种爆发式炎症反应，随后，代偿性的引起抗炎因子（如IL-4，IL-10，IL-13）激活而造成免疫抑制[5]。动物实验和临床研究证实，在创伤、烧伤、休克、严重脓毒症等病理状态下，肠道可发生不同程度的组织学和超微结构的改变，包括肠黏膜及黏膜下水肿、绒毛变短、肠上皮细胞分化、增殖加快，甚至肠道细胞坏死、凋亡，导致肠黏膜屏障功能损害，通透性增加、细菌毒素移位[6-7]。当细菌和（或）内毒素入血后，可激活或诱生大量促炎性介质或细胞因子，这些因素互为因果、相互激活、相互放大，导致局部甚至全身性不可控制性的炎症级联反应，最终发生MODS[8]。胃肠道作为体内最大的免疫器官，它是MODS的始动器官，而肠道损害和脓毒症互为因果，呈恶性循环，故其又是脓毒症的靶器官。

目前已确认的促炎细胞因子主要有TNF-α、IL-1β等,这些细胞因子在生物损伤和SIRS的发生发展的病理过程中扮演重要的角色，其分泌量增加以及引起的各种炎症因子的瀑布式释放，炎症反应过程中TNF-α是始动因素，IL-1β起到协同作用，IL-1β不能直接活化炎性白细胞，但可以引起IL-8的分泌，通过改变前炎症介质或抗炎症细胞因子的表达和影响组织多型核中性粒细胞（PMN）聚集而促进炎症的发展，从而引起组织细胞损伤[9-11]。

ICAM-1是一种具有多种生物学功能的跨膜糖蛋白，能介导细胞黏附、趋化、淋巴细胞归巢等，参与炎症和免疫反应，在机体的生理和病理过程中发挥作用。在某些细胞因子如白介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子（TNF）的作用下其表达增强，可导致组织器官炎症免疫损伤。有研究[12]发现，在肠道反应急性期，活化的血管内皮细胞表面的ICAM-1表达显著上调，而ICAM-1缺失小鼠的死亡率显著下降，肠道的炎症浸润和损伤程度较轻，直接证明ICAM-1在肠损伤发展中起重要作用。

中医无“脓毒症”病名，但根据其临床症状，参照中华中医药学会发布《中医内科常见病诊疗指南》（ZYYXH/T11.-2008），“脓毒症”可归为“外感热病”、“脱证”、“痞满”、“神昏”、“脏竭症”及“温毒”、“走黄”、“内陷”症等范畴。刘清泉[13]提出，正虚毒损、瘀滞络脉是脓毒症的基本病机，由于正气不足，毒邪内蕴，内陷营血，络脉气血营卫运行不畅，导致毒热、瘀血、痰浊内阻，瘀滞络脉，令各脏器受邪而损伤，引发该病。通腑益气汤是在经典大承气汤峻下通腑的基础上，加黄芪、当归而成，方中黄芪补气固脱、升阳举陷，当归活血补血，大黄、芒硝泻热通便，厚朴、枳实行气散结，并助芒硝、大黄加速积滞排泄。此方泻中有补，有降有升。

本研究结果显示，通腑益气汤组TNF-α、IL-lβ水平较氧氟沙星组和模型组明显降低（P＜0.05）。表明通腑益气汤可抑制炎症因子（TNF-α、IL-lβ）的过度表达；同时，通腑益气汤组ICAM-1水平较氧氟沙星组和模型组明显降低（P＜0.05），提示通腑益气汤能抑制全身炎症反应，进而下调ICAM-1的水平。模型组大鼠肠绒毛及固有层大片脱落，周围可见炎症细胞，可见固有层出血或溃疡；氧氟沙星组大鼠肠绒毛间隙增宽，绒毛和固有层部分脱落，毛细血管充血；通腑益气汤组大鼠肠绒毛顶端上皮下出现囊状间隙，排列尚规则，固有层与肠黏膜轻度分离，病理改变明显减轻。分别与氧氟沙星组和模型组比较，通腑益气汤组肠组织损伤病理学评分最低（P＜0.05）。病理结果提示，通腑益气汤灌胃治疗对脓毒症大鼠肠道炎症反应具有明显的抑制作用和对肠道良好的修复作用，可能机制为：通腑益气汤可能通过降低脓毒症大鼠的炎症反应，进而改善肠道微血管的通透性，减轻肠壁水肿，降低肠黏膜通透性，抑制肠道细菌移位和内毒素的吸收，修复肠绒毛，抑制并减轻肠黏膜炎症反应。本研究结果表明，通腑益气汤对脓毒症大鼠肠黏膜的保护作用可能与其抑制TNF-α、IL-lβ的过度激活，进而下调ICAM-1的水平有关。

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（收稿：2015-12-28 修回：2016-01-18）

Effect of Tongfu Yiqi Decoction on TNF-α,IL-lβ and ICAM-1 in Rats with Sepsis

Chunlian,XU Xiujuan,MENG Jianbiao,ZHANG Wei,HU Mahong. Department of Intensive Care Unit,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),ChinaLAI Zhizhen,JI

ObjectiveTo investigate the effects of Tongfu Yiqi decoction on serum levels of TNF-α,IL-lβ,and ICAM-1 and intestinal injury in rats with sepsis.MethodsThirty-six male SD rats were randomly divided into 3 groups:model group,ofloxacin group and Tongfu Yiqi decoction group（Chinese medicine group）,with 12 rats in each group.Sepsis model was reproduced by cecal ligation and puncture（CLP）.Ofloxacin group received ofloxacin （16mg/kg）via gastric infusion,Chinese medicine group received Tongfu Yiqi decoction（crude drug 1g/mL）with gastric infusion,once daily for 3 d,model group received an equal dose of normal saline in the same way.The serum concentrations of TNF-α,IL-lβ and ICAM-1 in each group were determined,the intestinal histopathological changes were evaluated and scored by light microscope after treatment.ResultsThe serum concentrations of TNF-α,IL-lβ and ICAM-1 in model group were 95.26±34.73ng/mL,30.83±12.32pg/mL,914.72±82.13pg/mL;those in ofloxacin group were 78.46±30.24ng/mL,24.72±10.53pg/mL,790.69±60.24pg/mL;those in Chinese medicine group were 60.38±21.81ng/mL,19.31±8.62pg/mL,681.69±52.62pg/mL;compared to other two groups,a significant decrease in those index in Chinese medicine group was noted（P＜0.05）.The scores of intestinal injury in model group, ofloxacin group,and Chinese drugs group were 4.21±0.61,3.56±0.32,2.84±0.27,respectively,with a significant difference among them（P＜0.05）.Conclusion Tongfu Qiyi decoction might suppress the release of inflammatory mediators（TNF-α,IL-lβ）and down-regulate ICAM-1 response to ameliorate the intestinal injury.

浙江省中医药科学研究基金项目（No.2012ZB015）

浙江省立同德医院重症医学科（杭州 310012）

胡马洪，Tel：13819197067；E-mail：gkim12395@126.com