HPLC法测定紫背天葵中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量的研究

邵考珍，何淑莹

佛山市南海区第七人民医院药剂科，广东 佛山 528247

HPLC法测定紫背天葵中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量的研究

邵考珍，何淑莹

佛山市南海区第七人民医院药剂科，广东 佛山 528247

目的：建立紫背天葵中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量测定的高效液相色谱法（HPLC）。方法：采用Shim-pack VPODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，0.5%磷酸-50%乙腈为流动相；检测波长为280 nm；流速0.8 mL/min；柱温30℃。结果：矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在0.05 μg～1 μg的范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 9），平均加样回收率为100.4%，RSD为1.3%（n=6）。结论：该方法可准确测定紫背天葵中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量，重复性好，可作为控制紫背天葵质量的一个重要指标。

紫背天葵；HPLC法；矢车菊素-3-O-葡萄糖苷；含量测定

紫背天葵是秋海棠科秋海棠属的多年生无茎草本植物，又名红天葵、红叶、红水葵、散血子等，分布于中国的广东、福建、江西、海南、香港、湖南、广西、福建、浙江等地，质量以肇庆鼎湖山出产的为佳。该药具有清热解毒、凉血、活血、润肺止咳的功效，主治暑热高烧，肺热咳嗽，咯血，跌打扭伤，血瘀疼痛，疮毒疥癣，水火烫伤等[1～2]。现代药理研究发现紫背天葵有抗氧化、自由基清除、扩张血管、抗血小板凝集、提高免疫力、抗癌等多方面的生物活性[3～6]。目前的紫背天葵成分研究表明，药材含有大量花色苷、黄酮苷和活性多糖化合物等有效成分，其中主要的成分是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷[7～12]。目前相关的研究报道主要集中在不同成分的提取及稳定性研究上，使用HPLC测定其成分的研究未见报道。本课题组采用HPLC法对8个不同产地的10批紫背天葵样品中的成分矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量进行测定。

1 材料和仪器

1.1 仪器与设备 Agilent 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)，包括：四元泵，脱气机，二极管阵列检测器，柱温箱，Chemstation工作站。R系列旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；HN-1006型超声波清洗机(广州市华南超声设备有限公司)。

1.2 药物与试剂 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品(批号：20160201)购自Hyphytochem公司，纯度≥98%；甲醇、乙腈为色谱纯(色谱试剂均购自德国默克股份公司)，其他试剂为分析纯，水为高纯水(高纯水为自制)。紫背天葵干品(干品的来源：广东肇庆2批，购自广州至信药业有限公司；广西桂林，广西玉林，网购自峻豪野生中药行；湖南永州、安徽亳州，网购自丰丰药行；福建南平2批、江西宜丰、广东阳江，网购自鑫淼中药材批发)，经广州市皮肤病防治所副主任中药师龙惠鉴定，均为秋海棠科秋海棠属的紫背天葵 Begonia fimbristipulate Hance[B.cyclophylla Hook.f.]干燥全草。

2 方法与结果

2.1 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品溶液的制备 取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇适量溶解，超声溶解，放冷，定容，制成0.1 mg/mL的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品贮备液。精密量取上述溶液2 mL，置10 mL量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，即得0.02 mg/mL的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 取不同产地的紫背天葵干品10批分别单独粉碎并过40目筛。精密称取不同产地的样品粉末各1 g，分别按照如下方法制备：置锥形瓶中，精密加甲醇25 mL，称定质量，超声处理30 min。取出，放冷至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的重量。摇匀，滤纸滤过，再以0.45 μm滤膜滤至进样瓶，即为供试品溶液。

2.3 色谱条件与系统适用性试验 采用色谱柱Shim-pack VP-ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以0.5%H3PO4(V/V)为流动相A，以50%乙腈为流动相B(V/V)，按表1的程序进行梯度洗脱；流速为0.8 mL/min；柱温30℃；检测波长为280 nm；进样量10 μL；运行时间为80 min。理论板数按矢车菊素-3-O-葡萄糖苷计算，不得低于3 000。不同产地来源的10批样品按照以下方法试验：分别精密吸取2.1、2.2项下的对照品溶液与供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，另取空白甲醇同法进样。结果显示，在对照品主峰相应的位置(16.67 min)，供试品显示相同的色谱峰(分离度＞1.5)，空白甲醇对测定无干扰，见图1～3。

表1 梯度洗脱程序表

2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.1”项下的对照品0.5mL、1 mL、2 mL、4 mL、8 mL、10 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得到浓度分别为5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的溶液。分别精密吸取上述溶液各10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程：Y=18.38X+0.8917(r=0.999 9，n=6)。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在0.05 μg/mL～1 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

图1 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品HPLC图

图2 产地广东肇庆的紫背天葵供试品HPLC图

图3 空白甲醇的HPLC图

2.5 精密度试验 精密吸取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积。结果矢车菊素-3-O-葡萄糖苷峰面积平均值为363.376，RSD为0.23%。表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批紫背天葵样品约1 g，精密称定，按照2.2项下的方法制备6份供试品溶液，依法进行测定。结果测得平均含量为0.039%，RSD为1.4%，表明本方法的重复性良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液各10 μL，分别于0、2、4、8、12、24小时注入液相色谱仪进测定，测得矢车菊素-3-O-葡萄糖苷平均含量为0.040%，RSD为0.9，表明供试品溶液在24 h内测定结果稳定。

2.8 加样回收率试验 见表2。取已知含量的同一批紫背天葵样品约0.5 g，各6份，精密称定，置三角瓶中，分别精密加入矢车菊素 -3-O-葡萄糖苷对照品溶液各 2 mL(0.1 mg/mL)，照供试品溶液方法处理，计算回收率。

表2 加样回收率测定结果

2.9 样品的含量测定 见表3。取不同产地的紫背天葵，按照2.2项下方法制备供试品溶液，依法测定矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量。

表3 不同产地紫背天葵样品的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量

3 讨论

3.1 吸收波长的选择 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷紫外可见光谱图显示，在280 nm及520 nm有最大吸收(见图4)。供试品在该两处波长下，前者峰较多、分离度良好，较好地体现出了紫背天葵样品的特征，而后者有仅寥寥数个峰。因此选择280 nm作为测定波长。通过对不同来源的10批样品进行含量测定，结果表明不同来源的紫背天葵表现出了不同的HPLC特征，所含矢车菊素-3-O-葡萄糖苷差异较大。其中以广东肇庆产的含量最高，达到0.068%，该结论跟传统鉴定中的道地药材是一致的，表明以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷做为紫背天葵的主要成分做检测是可靠的，该方法可以准确测定紫背天葵中的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量，重复性好，可作为控制紫背天葵质量的一个重要指标。

3.2 关于流动相的选择 本研究曾考察了甲醇—磷酸溶液、乙腈—磷酸溶液系统，结果以后者的峰形及分离较好。通过尝试不同比例的乙腈溶液与不同浓度的磷酸溶液进行梯度洗脱，最终确认了分离度较高的梯度洗脱程序。在设定的程序下，主峰分离度大于1.5，符合测定要求。同时考察了不同浓度的甲醇及不同的提取方法，包括回流提取、超声波提取法。结果表明，使用25倍量(W/V)纯甲醇超声30 min后，主成分基本溶出，操作简便、快捷。

图4 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷UV吸收光谱图

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（责任编辑：冯天保，郑锋玲）

Research on Content Determination of Procyanidin-3-O-glucoside in Begonia Fimbristipula Hance with HPLC

SHAO Kaozhen，HE Shuying

Objective：To establish high performance liquid chromatography(HPLC)method for content determination of Procyanidin-3-O-glucoside in Begonia Fimbristipula Hance.Methods：Adopted chromatographic column Shim-pack VP-ODS (250 mm×4.6 mm，5 μm，mobile phase was 0.5%Phosphoric acid-50% acetonitrile，detection wavelength was 280nm；flow rate was 0.8 mL/min and column temperature was 30℃).Results：Procyanidin-3-O-glucoside and peak area were in a good linear relationship(r=0.999 9)in the range of 0.05 μg～1 μg.The average sample recovery rate was 100.4%，RSD(relative standard deviation)was 1.3%(n=6).Conclusion：The therapy can determine contents of Procyanidin-3-O-glucoside in Begonia fimbristipula Hance accurately，with good repeatability.It’s an important indicator to control the quality of Begonia fimbristipula Hance.

Begonia fimbristipula Hance；High Performance Liquid Chromatography(HPLC)；Procyanidin-3-O-glucoside；Determination of content

R284

A

0256-7415（2016）12-0204-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.12.087

2016-07-03

邵考珍（1975-），女，主管中药师，研究方向：中药材的HPLC指纹图谱。