显色培养基分离婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的效果比对和应用

程晓云，李建梅

（云南省产品质量监督检验研究院，云南 昆明 650223）

显色培养基分离婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的
效果比对和应用

程晓云，李建梅

（云南省产品质量监督检验研究院，云南 昆明 650223）

分析广东环凯公司阪崎肠杆菌显色培养基（CRM006）和科玛嘉阪崎肠杆菌显色培养基（DFI）的实验应用效果，为检测婴幼儿乳粉中的阪崎肠杆菌选用培养基提供依据。按照《食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验》（GB/T 4789.40-2010）分离及生化鉴定阪崎肠杆菌，并分析培养基的分离效果。结果表明，36份样品中，检出阪崎肠杆菌2份，检出率为5.56%；CRM平板和DFI平板阳性符合率为100%；疑似菌落检出率分别为16.67%和13.89%（P＞0.05）。CRM平板和DFI平板用于培养分离阪崎肠杆菌均有良好效果。

乳粉；阪崎肠杆菌；显色培养基；分离鉴定效果

阪崎肠杆菌（E. sakazakii）是引起人们广泛关注的一种危险的条件致病菌，是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌，属肠杆菌科，肠杆菌属，是肠道正常菌群中的一种，在1980年前一直被称为黄色阴沟肠杆菌。阪崎肠杆菌是近几年在乳制品中新发现的一种致病菌。研究表明含有阪崎肠杆菌的婴儿配方奶粉可引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率达50%以上。因此检测婴儿配方奶粉及制品中的阪崎肠杆菌十分重要。

我国在2005年5月通过《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》行业标准的审定，对奶粉严查此菌。因此，按国家食品安全标准规定，阪崎肠杆菌在婴儿配方乳粉中不得检出。阪崎肠杆菌的检测方法需要分离培养、镜检观察、生化鉴定等多个步骤，检测周期长，整个过程约6～7 d，且操作复杂，选择良好的培养基是准确分离、早期发现阪崎肠杆菌的良好方法。国家标准《食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验》（GB/T 4789.40-2010）规定，采用阪崎肠杆菌显色培养基作为分离该菌的培养基。[1]阪崎肠杆菌显色培养基是实验室常用的检测婴幼儿乳粉中的阪崎肠杆菌的培养基，主要利用阪崎肠杆菌自身代谢产生的α-葡萄糖苷酶与相应显色底物反应显色的原理来检测。为分析国产与国外显色培养基在婴幼儿乳粉中分离阪崎肠杆菌的分离效果，笔者于2013-2015年采用广东环凯公司阪崎肠杆菌显色培养基（CRM）和河南科玛嘉阪崎肠杆菌显色培养基（DFI）同时检测36份婴幼儿乳粉，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 样品来源

2014-2015年间，采集的婴幼儿奶粉，共36份。样品来自国内外不同的生产厂家，在云南省流通市场购买。

1.2 培养基和试剂

CRM，DFI，胰蛋白胨大豆琼脂（TSA），改良硫酸盐胰蛋白胨肉汤，万古霉素（Mlst-Vm）,革兰氏染液，阪崎肠杆菌生化鉴定试剂盒等，均购自广东环凯生物科技有限公司，所用的培养基和试剂均按操作说明书进行。选用法国梅里埃公司全自动生化鉴定系统对比鉴定显色培养基。[2]

1.3 方法

国家标准GB/T4789.40-2010《食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验》方法第一法。

（1）阪崎肠杆菌的培养分离及生化实验。①前增菌和增菌：取试样100 mL，加入已预热至44 ℃装有900 mL得缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，充分溶解，于（36±1）℃培养16～20 h。用移液管移取1 mL接种于10 mL ST-Vm肉汤中，（44±0.5）℃培养22～26 h。②分离：将mLST-Vm( (每 10mL mLST 溶液中加 0.1mL的万古霉素))肉汤混匀，各取增菌培养液一环，分别划线于CRM平板和DFI平板，（36±1）℃培养22～26 h。在CRM平板和DFI平板上，阪崎肠杆菌在两种平板上均呈蓝绿色典型菌落。挑取1～5个可疑菌落，划线接种于TSA平板。（25±1）℃培养（48±4）h。③生化鉴定：自TSA平板上挑取黄色可疑菌落，进行生化试验，结果见表1。鉴定阳性菌株为ATCC29544标准指控菌株。[3]

表1 生化试验结果统计表

（2）分离鉴定。将疑似菌落分离纯化，革兰氏染色后，选用法国梅里埃公司鉴定卡（阴性卡）进行仪器生化鉴定和确认。

（3）质量控制。阪崎肠杆菌鉴定阳性菌株为ATCC29544标准指控菌株。

（4）统计学处理。采用SPSS21.0软件，率的比较用Χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

36份样品中，生长疑似菌落份数在CRM平板和DFI平板上分别为6份和5份，疑似菌落份数检出率分别为16.67%和13.89%，差异无统计学意义（Χ2=0.08，P＞0.05）；在2份阳性加标样品中，两者结果一致，阳性符合率为100%，见表2。

表2 CRM平板和DFI平板分离阪崎肠杆菌结果比较表

3 讨论

我国在颁布检测阪崎肠杆菌国家标准前，阪崎肠杆菌显色培养基（DFI琼脂）细菌荚膜染色法。

3.1 原理与应用

细菌荚膜是细菌细胞壁外面的一层黏液性物质，对染料的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染色，即使菌体和背景着色而荚膜不着色，因此在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜含水量在90%以上，染色时一般不用热固定，以防荚膜皱缩变形。荚膜染色法用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、炭疽芽胞杆菌和产气荚膜梭菌等有荚膜细菌的鉴定。[4]

3.2 材料

荚膜菌液；结晶紫酒精饱和液5 mL，加蒸馏水95 mL混合液；200 g/L硫酸铜水溶液。

3.3 方法

将荚膜菌涂片在空气中自然干燥，不需加热固定。滴加结晶紫染色液，在火焰上微微加热，使玻片上染液冒蒸汽为止，用200 g/L硫酸铜水溶液冲洗染液，切勿用流水冲洗。用吸水纸吸干后油镜观察。

4 结果

细菌菌体呈紫色，荚膜呈淡紫色或无色。阪崎肠杆菌显色培养基具有较高的选择性和特异性，且两种培养基的特异性无明显差别，可以达到相同的灵敏度和检测限，显色培养基对阪崎肠杆菌的特异性高，抗干扰性强。

5 结语

显色培养基在婴幼儿奶粉微生物检测中的应用，可大大提高检出率和减少检测时间，应用显色培养基鉴定细菌是一种快捷方便易推广的快速检测方法，通过显色培养基的特异性酶的显色底物，直接观察菌落颜色即可初步鉴定菌种，具有快速、简便、节约成本等优点。结果显示，增菌液在37 ℃培养时，在显色培养基上分离会出现假阳性的菌落，而在44 ℃培养时，即可排除此干扰。所以在实际检测中仍然需要检测人员提高对检测样品的前增菌方法和对阪崎肠杆菌显色培养基特异性和灵敏度的及时严格地按国家标准方法进行观测，才能有效提高样品检测率。[5]

[1]中华人民共和国卫生部. GB/T 4789.40-2010 食品微生物学检验 食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验[S].北京：中国标准出版社，2010.

[2]吴清平，周艳红，蔡芷荷.卫生微生物特异性显色培养基的研究与应用[J].中国卫生检验杂志，2005（1）：124-126.

[3]吴清平，叶应旺，郭伟鹏，等.阪崎肠杆菌的生物学特性及其检测技术[J].微生物学报，2006（6）：99-103.

[4]杨万颖，祝仁发，李传礼，等.婴幼儿食品中阪崎肠杆菌方法的改进[J].检疫检验科学，2008（2）：39-42.

[5]卢勉飞，蔡芷荷，吴清平，等.阪崎肠杆菌培养基的应用研究[J].微生物学报，2009（11）：1789-1793.

Comparison and Application the Effect of Chromogenic Medium for the Isolation of E. sakazakii in Infant Milk Powder

Cheng Xiaoyun, Li Jianmei
(Institute of Product Quality Supervision and Inspection, Yunnan Province, Kunming 650223, China)

This paper analysis the application effect of CRM006 and DFI to provide the basis for the medium selection for detection of E. sakazakii in infant milk powder. Isolation and biochemical identification the E. sakazakii according to GB/T 4789.40-2010 and analysis of the separation effect of medium. The result shows that 2 of the 36 samples has E. sakazakii, detection rate is 5.56%; CRM tablets and DFI tablet positive coincidence rate is 100%; Suspected colonies detection rate were 16.67% and 13.89% respectively (P＞0.05). CRM tablets and DFI tablet used for separation of E. sakazakii has good effect.

Milk powder; E. sakazakii; Chromogenic medium; Separation ident ification

R155.5

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.22.035