大黄末中没食子酸的鉴别及含量测定方法研究

蔡文金, 包爱情, 陆春波

(浙江省兽药饲料监察所，杭州 310012)

大黄末中没食子酸的鉴别及含量测定方法研究

蔡文金, 包爱情, 陆春波

(浙江省兽药饲料监察所，杭州 310012)

为了完善大黄末的质量控制方法，对大黄末中没食子酸的薄层鉴别和含量测定方法分别进行了研究。采用薄层色谱法鉴别没食子酸以及高效液相色谱法测定其含量。选用Agilent Eclipse XDB-C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)为色谱柱，甲醇-0.05%磷酸溶液(5∶95)为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长为271 nm。试验结果没食子酸在1.064～106.4 μg/mL浓度范围内，线性关系良好(r= 1.0000)；平均回收率(n=6)为97.84%(RSD=0.61%)。薄层色谱斑点清晰，分离度好。本方法准确灵敏，可用于大黄末中没食子酸的质量控制。

大黄末；没食子酸；薄层色谱法；高效液相色谱法

大黄末收载于《中国兽药典》二O一O年版二部，为单味大黄制成的中兽药散剂[1]。具有健胃消食，泻热通肠，凉血解毒，破积行瘀功效，用于食欲不振，实热便秘，结症，疮黄疔毒，目赤肿痛，烧伤烫伤，跌打损伤，还可以用于治疗鱼肠炎，烂鳃，腐皮[2]。大黄为常用中药, 主要含有蒽醌类、二苯乙烯苷类、苯丁酮类, 鞣质及相关的多酚类成分。现代药理表明蒽醌类为大黄泻下作用的主要有效成分，没食子酸等鞣质为大黄收敛止血作用的主要有效成分[3]。大黄末现行质量标准中仅有蒽醌类的薄层色谱鉴别和含量测定，无鞣质的鉴别和含量测定。查阅文献，未发现有大黄中没食子酸薄层色谱鉴别的相关报道，本试验参照石榴皮药材中的没食子酸鉴别[1]和含量测定方法[4-5]，对大黄末中没食子酸的薄层鉴别和含量测定方法分别进行了研究。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2695 高效液相色谱仪，配Waters 2996二极管阵列检测器，美国Waters公司；AUTOMATIC TLC SAMPLER 4全自动点样仪，ADC2自动展开仪和TLC VISUALIZER 薄层色谱成像系统，瑞士KAMAG公司； XS-205电子天平(感量0.01 mg)，瑞士METTLER TOLEDO公司；KQ-500E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试剂与材料 甲醇为色谱纯，Merck 公司，其余试剂均为分析纯；实验用水为milli-Q 超纯水。硅胶G薄层板，100 mm×200 mm，厚度0.20～0.25 mm，青岛海洋化工厂生产。没食子酸对照品(中国食品药品检定检验院，批号：110831-201204，含量：89.9%)。大黄末样品(批号分别为20141101，20141102，20141103)，浙江歌德动物药业生产；大黄末样品(批号分别为20150301，20150302，20150303，20141203)，浙江东贸药业生产。

2 方法与结果

2.1 没食子酸的薄层色谱鉴别 取供试品10 g，加无水乙醇30 mL，加热回流1 h，滤过，取滤液蒸干，加水20 mL使溶解，滤过，滤液用石油醚(60～90 ℃)提取2次，每次20 mL，弃去石油醚液，水液再用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取没食子酸对照品10 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。照薄层色谱法，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷(用水饱和)-乙酸乙酯-甲酸(6:5:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。斑点清晰，分离度好。结果见图1。

图1 没食子酸薄层鉴别图谱

2.2 没食子酸的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.05%磷酸溶液(5∶95)；流速1.0 mL/min；采集波长200～400 nm，分辨率为1.2 nm；进样量：20 μL；柱温30 ℃。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品23.68 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，为对照品储备液。精密量取上述溶液5 mL，置100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得21.29 μg/mL的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取大黄末约0.1 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加水20 mL，超声提取30 min，静置30 min，再加水至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 系统适应性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液注入液相色谱仪，同时记录光谱图和271 nm处的色谱图，分别见图2、图3。在该色谱条件下，理论板数按没食子酸峰计为10403，没食子酸可以得到很好的分离。

图2 没食子酸光谱图

图3 对照品溶液(A)和供试品溶液(B)色谱图

2.2.5 线性关系考察 分别精密量取对照品储备液适量，用水稀释成浓度约为1、2、5、10、20、50、100 μg/mL的系列溶液，精密量取20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，所得线性方程为：

Y=64897X-11277(r=1.0000)。结果表明没食子酸对照品溶液在1.064～106.4 μg/mL浓度范围内，线性关系良好。2.2.6 精密度试验 精密量取浓度为53.22 μg/mL的对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，按2.2.1色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果没食子酸峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.4 %，表明精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一批供试品溶液(批号20141103)，分别在样品处理后的0、2、4、6、8、12 h进样，测定峰面积相对标准偏差(RSD)为0.8%，表明溶液在12 h内稳定。

2.2.8 重复性试验 取大黄末样品(批号20141103)5份，按“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液，分别进样测定含量。结果样品中没食子酸含量的相对标准偏差(RSD)为0.7%，说明方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取“2.2.8”项下已测含量的大黄末样品(批号20141103)0.05 g，共 6份，精密称定，置25 mL量瓶中，分别加212.9 μg/mL没食子酸对照品储备液850 μL，按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下条件检测，回收率结果见表1。

表1 回收率试验结果

2.2.10 样品的测定 取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算没食子酸含量，结果见表2。

3 讨论与小结

3.1 TLC鉴别中展开系统以及薄层板的选择 考察了乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)、甲苯(用水饱和)-乙酸乙酯-甲酸(6∶3∶1)、石油醚(60～90℃)(用水饱和)-乙酸乙酯-甲酸(6∶5∶1)以及环己烷(用水饱和)-乙酸乙酯-甲酸(6∶5∶1)4种展开系统，结果表明：采用乙酸乙酯-丁

表2 大黄末中没食子酸含量测定结果

酮-甲酸-水(10:1:1:1)色谱系统分离度较差；采用甲苯(用水饱和)-乙酸乙酯-甲酸(6∶3∶1)Rf值为0.16，偏小；采用石油醚(60℃～90℃)(用水饱和)-乙酸乙酯-甲酸(6∶5∶1)以及环己烷(用水饱和)-乙酸乙酯-甲酸(6∶5∶1)分离度均较好，Rf值分别为0.57和0.60，但前者的斑点有扩散，综合考虑采用环己烷(用水饱和)-乙酸乙酯-甲酸(6∶5∶1)作为展开系统。

对硅胶G薄层板及聚酰胺薄膜做了比较，采用5 μL点样，喷以1%三氯化铁乙醇溶液以后观察，硅胶G薄层板显色更清晰，因此选用硅胶G薄层板。

3.2 含量测定中流动相及超声条件的选择 采用DAD在200 nm～400 nm进行全波长扫描，没食子酸对照品，在215.6 nm与271.0 nm波长处有最大吸收，215.6 nm波长太短，试剂容易产生干扰，故选择271 nm波长作为检测波长。参考文献[4-6]对流动相的组成及不同比例进行了考察，发现流动相中加入磷酸有助于改善峰型，减少拖尾。选择甲醇-0.1%磷酸溶液(15∶85)、甲醇-0.05%磷酸溶液(5∶95)、乙腈-0.05%磷酸溶液(5∶95)等系统作为流动相，试验结果发现，采用甲醇-0.05%磷酸溶液(5∶95)为流动相，没食子酸与其他组分色谱峰可以得到较好的分离。

分别选择超声、加热回流、浸渍30 min的方法考察，结果表明超声与回流提取效果相当，均好于浸渍，考虑到超声操作便捷，故采用超声方法。考察水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇超声提取30 min，结果表明水的提取效果最佳，这与范晓红等的研究[7]基本一致。

超声15、30、45 min，考察超声时间对试验的影响，结果表明提取时间在15 min时提取不够充分，而当提取时间延长至45 min时与30 min并无显著差异。故选择超声时间为30 min。

本试验所采用的大黄末来自2个兽药企业7批次样品，不同批次大黄末样品中没食子酸的含量存在一定差异。但因采用的大黄药材受炮制加工[8]等因素影响较大，要制订含量限度尚需进行收集大量样品进一步研究。

结果表明，在该薄层色谱条件下，没食子酸的薄层色谱斑点清晰，分离度好；在该液相色谱条件下，没食子酸峰与相邻组分峰的分离度好，该方法的精密度、重复性、回收率试验均符合规定，操作简便、快速，可作为制定大黄末质量标准的参考依据。

[1] 中国兽药典委员会. 中国兽药典二O一O年版二部[S].[2] 中国兽药典委员会. 兽药使用指南中药卷二O一O年版 [S].[3] 匡海学. 中药化学[M]. 北京: 中国中医药出版社, 2003:94.

[4] 王云, 李丽, 张村, 等. 大黄5种饮片没食子酸和儿茶素的含量比较影响[J]. 中国中药杂志, 2010, 35 (17):2267-2269.

[5] 沈华, 王正, 李蕾, 等. HPLC法同时测定没食子提取物中没食子酸、没食子酸甲酯和没食子酸乙酯的含量[J]. 齐鲁药事, 2014, 33(11):631-632.

[6] 张朔生. HPLC测定炮制前后石榴皮中没食子酸的含量[J]. 药物分析杂志, 2010, 30(6):1104-1106.

[7] 范晓红, 李治建, 斯拉甫﹒艾白, 等. 没食子中没食子酸含量测定及总鞣质提取方法的研究[J]. 时珍国医国药, 2011, 22(5):1119-1121.

[8] 雷鹏, 李新中, 朱诗塔, 等. 不同炮制方法对大黄中没食子酸含量的影响[J]. 中药新药与临床药理, 2008, 19(6):477-479.

(编辑：陈希)

Study on the Determination and Identified of Gallic Acid in Rhubarb Powder

Cai Wen-jin, Bao Ai-qing, Lu Chun-bo

(ZhejiangProvinceInstituteofveterinaryDrugandFeedstuff,Hangzhou310012,China)

To perfect the quality control method of rhubarb powder. Gallic acid was identified by thin layer chromatography (TLC) and determined by high performance liquid chromatography (HPLC). A chromatographic column of Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm ×4.6 mm, 5 μm) was used, with the mobile phase of methanol - 0.05% phosphoric acid solution (5∶95) at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was at 271 nm. The calibration curves were linear in ranges of 1.064～106.4 μg/mL(r= 1.0000)for gallic acid; the average recoveries (n=6) was 97.84%(RSD=0.61%). The method is accurate and sensitive for the quality control of rhubarb powder.

rhubarb powder; gallic acid; TLC; HPLC

蔡文金，女，助理兽医师，从事中兽药检验和质量标准研究工作。E-mail:lucb02@163.com

2015-09-06

A

1002-1280 (2016) 01-0052-04

S853.7