一株新型鸭肝炎病毒的分离与鉴定

陈生雷，李凤艳，郭华，边少国，项伟，舒秀伟，苗玉和

(辽宁益康生物股份有限公司，辽宁辽阳 111000)

一株新型鸭肝炎病毒的分离与鉴定

陈生雷，李凤艳，郭华，边少国，项伟，舒秀伟，苗玉和

(辽宁益康生物股份有限公司，辽宁辽阳 111000)

从辽宁省某鸭场疑似鸭病毒性肝炎病料中分离到一株病毒，经PCR检测初步鉴定其为鸭肝炎病毒，命名为YK株，应用易感鸭胚和雏鸭进行传代及病毒含量测定，E1～E5代鸭胚适应毒病毒含量在106.5～106.9ELD50/0.2 mL之间，E2代鸭肝组织毒病毒含量为106.3LD50/0.1 mL。动物试验结果表明，YK株鸭胚适应毒E2代对7日龄雏鸭的致死率高达100%。序列测定分析表明，YK株与DHV-A的VP1基因同源性在71.4%～72.3%之间，与DHV-B的VP1基因同源性在71.9%～72.3%之间，与DHV-C的VP1基因同源性在94.3%～98.8%之间。试验表明，YK株与韩国新型鸭肝炎病毒在同一分支上，属于基因C型DHV。

鸭肝炎病毒；分离；鉴定

鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus，DHV)引起的一种传播迅速并高度致死雏鸭的病毒性传染病，以发病急、传播快、病程短、死亡率高为主要特征，主要侵害4周龄以内雏鸭，1周内最易感，死亡率可高达90%以上[1-2]。研究表明，鸭肝炎病毒有三个血清型，即Ⅰ型(DHV-1)及其变异株(la型)、Ⅱ型(DHV-2)和Ⅲ型(DHV-3)，DHV-2和DHV-3又分别被称为台湾新型和韩国新型，三个血清型之间没有交叉保护和交叉中和作用。

为了更好地研究鸭病毒性肝炎的病原，根据DHV的基因进化规律又将其分为A、B、C型，分别对应原有的DHV-1、台湾新型、韩国新型[3-5]。新型的鸭肝炎病毒的出现给养鸭业带来了严重的经济损失。近年来，戴玉婷[6]、孙林杰[7]、张雪[8]等相继报道了与DHV-1不同的新型鸭肝炎病毒。本试验对辽宁省疑似鸭病毒性肝炎病鸭进行了病原分离和鉴定，以期为鸭病毒性肝炎的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 DHV-1型病毒SDE株及其阳性血清，由辽宁益康生物股份有限公司提供；疑似DHV病料来自辽宁省一鸭场的发病鸭。

1.2 实验动物 易感鸭胚及健康易感雏鸭，由辽宁益康生物股份有限公司提供，使用前检测抗体为阴性。

1.3 试剂 核酸提取试剂盒和RT-PCR一步法试剂盒，购自北京全式金生物科技有限公司。

1.4 病毒鉴定与增殖

1.4.1 RT-PCR初步鉴定 根据GenBank中已公布的新型鸭肝炎病毒全基因序列，设计引物，上游引物：5’-AGCACGAGAGACCCTTACG-3’，下游引物：5’-CCCACAGGCTCTCACTAAAG-3’，由宝生物工程(大连)有限公司合成。将采集的病料处理后，应用上述特异性引物按程序进行RT-PCR扩增，产物于1%琼脂糖凝胶电泳后观察，预计扩增片段长度为770 bp。

1.4.2 在鸭胚上增殖 将无菌采集的病鸭肝脏在灭菌的研磨器内充分研磨，用灭菌生理盐水制成l︰5乳剂，3000 r/min 离心30 min，取上清液，加青、链霉素，使终浓度为2000 IU/mL，4 ℃过夜。取11日龄易感鸭胚20枚，分为2组，第1组为试验组，经尿囊腔途径接种病料，0.2 mL/胚；第2组为对照组，经尿囊腔途径接种灭菌生理盐水，0.2 mL/胚。接种后继续孵化，每日照蛋2次，收获24～144 h死亡胚尿囊液，观察胚体及内脏病变，参照《中国兽药典》[9]经无菌、支原体及外源病毒检测合格后冻干保存、备用。按此方法连续传代。

1.4.3 在易感雏鸭上增殖 将1.4.2样品做100倍稀释后，经胸部肌肉注射7日龄雏鸭，0.1 mL/只。观察7日，无菌采集攻毒后死亡且具有典型病变的鸭肝脏，研磨后分装，-20 ℃保存。

1.4.4 对鸭胚的半数致死量测定 取分离株鸭胚尿囊液作10倍系列稀释，取适宜稀释度经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，每个稀释度接种5枚，0.2 mL/枚，37 ℃孵育，观察7日，记录鸭胚死亡情况，按Reed-Muench 法计算鸭胚半数致死量(ELD50)[9]。

1.4.5 对易感雏鸭的半数致死量 将肝组织毒E2经10倍系列稀释，取适宜稀释度经胸部肌肉注射7日龄易感雏鸭，每个稀释度接种6只，0.1 mL/只，观察10日，计算雏鸭半数致死量(LD50)[9]。

1.4.6 动物致病性试验 取7日龄雏鸭20只，随机分为2组，第1组将收获的E2代鸭胚尿囊液作10倍稀释，经胸部肌肉接种雏鸭10只，0.2 mL/只；第2组将0.85%灭菌生理盐水经胸部肌肉接种雏鸭10只，0.2 mL/只，作为对照组。观察10日，记录发病死亡情况，死亡鸭解剖观察病理变化。

1.4.7 特异性血清中和试验 采用固定病毒稀释血清法进行测定，将鸭胚适应毒E2代和SDE株E2代病毒液稀释至病毒含量为200 ELD50/0.1 mL，取适宜稀释度SDE株阳性血清与等量的200 ELD50病毒液混合，37 ℃中和1 h，0.2 mL/枚，同时设立血清对照和病毒对照组，5枚/组，37 ℃孵育7日，记录各组死亡情况。1.4.8 基因序列测定与分析 将PCR产物送至宝生物工程(大连)有限公司进行测序，并将结果用DNAStar软件进行序列分析，参考序列见表1。

表1 参考序列

2 结果

2.1 分离鉴定结果 将临床疑似鸭肝炎病例的感染动物，采集肝组织，经研磨处理经RT-PCR初步鉴定为新型鸭肝炎病毒(图1)，此病毒能在鸭胚上增殖，并能使7日龄易感雏鸭发病。

M：DL2000 Marker；1：YK株鸭胚毒；2：YK株肝组织毒；3：SDE株；4：阴性对照图1 RT-PCR结果

2.2 鸭胚传代及病毒含量测定 在11日龄鸭胚上连续传代至E5代，接种鸭胚后死亡时间主要集中在96～120 h，死亡胚皮下出血、水肿，肝脏有明显的坏死灶或坏死点(图2)，对照组鸭胚则全部存活。传至E3代后鸭胚死亡规律，毒价稳定，表明该分离株能很好的适应11日龄易感鸭胚。结果见表2。

表2 鸭胚传代死亡比例及病毒测定结果

2.3 雏鸭半数致死量测定 将YK株E2代肝组织毒应用7日龄易感雏鸭进行半数致死量测定，易感雏鸭于攻毒后24 h开始死亡，死亡高峰集中在24～48 h，死亡雏鸭呈现典型的角弓反张状态，剖检肝脏有明显的点状出血。结果YK株E2代肝组织毒对雏鸭的半数致死量为106.3LD50/0.1mL。2.4 动物致病性试验 第1组试验鸭攻毒后24 h开始发病死亡，72 h全部死亡，死亡主要集中在攻毒后24～48 h，共死亡20只，致死率高达100%；临床症状为突然发病，精神萎靡，食欲废绝，发病片刻即倒地，先是两腿向上作游泳样划动，后头部向后仰，呈现角弓反张状。解剖死亡鸭，肝脏肿胀，呈土黄色，有明显的出血斑点，其他脏器无显著变化，剖检结果见图3。第3组对照鸭则全部健康存活。

2.5 血清中和试验 表3结果表明，YK株不能被Ⅰ型鸭肝炎病毒阳性血清中和，SDE株能被Ⅰ型鸭肝炎病毒阳性血清中和，说明YK株和SDE株为不同血清型。

图2 YK株接种后鸭胚及肝脏病变

图3 攻毒后死亡雏鸭及病变肝脏

毒株鸭胚死亡比例DHV-1阳性血清病毒对照空白对照YK株5/55/50/5DHV-1型SDE株0/55/5/

2.6 测序分析 应用设计引物，对YK株进行RT-PCR扩增并将产物进行测序，将测序结果与鸭肝炎病毒VP1基因序列进行比对，并构建进化树。结果显示，YK株与DHV-C型基因同源性为94.3%～99.0%，与台湾新型(04G和90D)基因同源性分别为71.9%和72.3%，该分离株与DHV-C型属于同一基因型，且与DHV-B型相邻，但与DHV-A处于不同的分支。结果见图4、图5。

图4 YK株测序结果进化分析

图5 不同毒株基因序列比较分析

3 讨论与小结

本试验应用RT-PCR检测，对辽宁省某地发病鸭初步鉴定为新型鸭肝炎病毒，并使用易感鸭胚对病料进行分离传代培养，该分离株经病毒含量测定、半数鸭胚致死量测定、本动物回归试验、血清中和试验鉴定为为DHV-C型鸭肝炎病毒，并命名为YK株。

目前鸭病毒性肝炎的预防与治疗主要以Ⅰ型的弱毒疫苗和卵黄抗体制剂为主，但Ⅰ型和新型的鸭肝炎病毒之间不具备交叉保护。本研究中成功分离到DHV-C型鸭肝炎病毒，为进一步研制针对DHV-C型鸭肝炎病毒的抗体制剂或疫苗奠定了基础。

[1] 陆承平. 兽医微生物学[M]. 3版. 北京: 中国农业出版社，2001.

[2] 刘美玲. 鸭病毒性肝炎的流行病学特征及防制[J]. 中国畜牧兽医， 2008，35(7)： 103-104.

[3] Kim M C，Kwon Y K，Joh S J，etal． Recent Korean isolates of duck hepatitis virus revealed the presence of a newgeno-and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 type strain[J]. Arch Virol， 2007，152 (11) ： 2059-2072．

[4] Wang L，Pan M，Fu Y，etal． Classification of duck hepatitis virus into three genotypes based on molecular evolutionary analysis[J]. Virus Genes，2008，37(1) ：52-59．

[5] 韦天超，石梦霞，兰奉瑜，等. 一株广西新型鸭肝炎病毒的分离与初步鉴定[J].广西畜牧兽医，2012，28(5):259-260.

[6] 戴玉婷,王杉，宋扬，等. 鸭甲肝病毒VP1基因克隆及序列分析[J]. 中国兽药杂志，2015，49(2)：18-21.

[7] 孙林杰，王雪平，宋国亮，等.一株鸭肝炎病毒的分离与鉴定[J].中国兽药杂志，2014，48(4)：15-18.

[8] 张雪，龚文孝，胡勇，等.Ⅰ型鸭肝炎病毒基因C型株的分离与鉴定[J]. 动物医学进展，2015，36(1)：23-26.

[9] 中国兽药典委员会. 中和人民共和国兽药典[S]. 2010版. 北京：中国农业出版社，2011.

(编辑：李文平)

Isolation and Identification of a Duck Hepatitis Virus Strain

CHEN Sheng-lei, LI Feng-yan, GUO Hua, BIAN Shao-guo,XIANG Wei, SHU Xiu-wei, MIAO Yu-he

(LiaoningYikangBiologicalCo.,Ltd,Liaoyang,Liaoning111000,China)

A virus strain was isolated from suspected duck viral disease from dead duck in liaoning Province,and identified by reverse-transcriptase polymerase chain reaction.It is a duck hepatitis virus that named YK strain.The isolates were passed from E1to E5,the titer determination in duck embryos were from 106.5to 106.9ELD50/0.2 mL; the titer determination in duckling hepatitis tissue titer was 106.3/0.1mL at E2. Animal regression experimental results showed that The YK strain in duck embryos to 7- day- old duckling mortality was 100%.Sequence comparison with DHV-A serotype showed that the identity was 71.4%～72.3%, 71.9%～72.3% with DHV-B serotype and 94.3%～98.8% with DHV-C serotype.It proves that the YK strain and new serotype strain in Korea belongs to DHV-C serotype.

duck hepatitis virus；isolation；identification

陈生雷，兽医师，从事生物制品研究工作。E-mail: chenshenglei1028@163.com

2015-09-18

A

1002-1280 (2016) 01-0019-05

S852.65