金霉素和代谢物差向金霉素在肉鸡肌肉和肝脏中的残留分布

高强，庞茂达，裴燕，王冉，王波，张杨杨，谢恺舟*，张跟喜，戴国俊，王金玉

(1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009；2.江苏省动物遗传繁育与分子设计重点试验室，江苏扬州225009；3.江苏省农业科学院江苏省畜禽产品安全性研究重点实验室，南京 210014)

金霉素和代谢物差向金霉素在肉鸡肌肉和肝脏中的残留分布

高强1,2，庞茂达3，裴燕1,2，王冉3，王波1,2，张杨杨1,2，谢恺舟1,2*，张跟喜1,2，戴国俊1,2，王金玉1,2

(1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009；2.江苏省动物遗传繁育与分子设计重点试验室，江苏扬州225009；3.江苏省农业科学院江苏省畜禽产品安全性研究重点实验室，南京 210014)

为了研究金霉素(CTC)、差向金霉素(ECTC)在肉鸡肌肉、肝脏中的残留分布情况，样品经提取液提取后过Oasis HLB SPE小柱净化，采用电喷雾正离子模式(ESI+)和多反应监测模式(MRM)，用高效液相色谱-串联质谱仪检测；试验组鸡按体重以50 mg/(kg·d)剂量内服CTC，连续5 d，每天给药1次。结果表明：该方法测定肉鸡肌肉和肝脏中CTC检测限和定量限分别为5.0、10.0 μg/kg。ECTC检测限和定量限分别为20.0、30.0 μg/kg。CTC和ECTC在肉鸡肌肉中平均回收率分别在73.00%～95.20%和81.80%～101.60%，相对标准偏差(RSD)分别在8.85%～9.13%和2.05%～9.29%；在肉鸡肝脏中平均回收率分别在67.06%～90.80%和78.64%～106.98%，RSD分别在2.90%～8.88%和4.72%～9.48%；肉鸡肌肉和肝脏中CTC、代谢物ECTC的残留量分别在给药后第1、5 d时达到最高。肉鸡肝脏中ECTC的残留量约占总残留量的1/2。停药后CTC及其代谢物ECTC代谢缓慢，在停药第6 d时，仍能检测到CTC及其代谢物ECTC，但其残留量均低于最高残留限量(MRLs)。从保障食品安全方面考虑，建议我国将CTC和ECTC均作为金霉素的残留标示物进行监测。

金霉素；差向金霉素；残留分布；肉鸡肌肉；肉鸡肝脏

金霉素(Chlortetracycline，CTC)又称氯四环素，因其药效高、价格低，被广泛的应用于畜禽养殖业中，但金霉素的不规范应用，使得动源性食品中金霉素的残留对人类的健康及生态环境造成了一定的危害，尤其是一些常见的病原菌对CTC已产生耐药性，从而导致药效的降低。因此，各国对CTC在动源性食品中的最高残留限量(MRLs)做了明确的规定，我国和欧盟均规定了CTC在鸡肌肉、鸡肝脏中的最高残留限量分别为0.1、0.3 mg/kg[1-2]。差向金霉素(4-Epi-chlortetracycline，ECTC)是CTC在弱酸条件下转化而成的差向异构体，是CTC在动物体内的主要代谢产物之一，也具有一定的副作用，目前已经被欧盟确定为残留标示物，且规定在鸡肌肉、鸡肝脏中的最高残留限量分别为0.1、0.3 mg/kg[2]。

目前，国内外研究CTC在动物组织中的残留检测方法虽然在羊[3]、猪[4-5]、牛奶和牛肉[6]中有较多报道，但研究CTC和代谢物ECTC在肉鸡肌肉和肝脏中的残留分布情况尚未见报道。本试验通过胶囊给药，试验组鸡按50 mg/(kg·d)剂量内服CTC，连续5 d给药，测定从给药期到休药期CTC、代谢物ECTC在肉鸡肌肉和肝脏中的残留分布情况，为监控CTC在肉鸡体内的代谢以及CTC在临床上的合理用药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及分组 选取1日龄健康AA肉鸡100只，厚垫料平养至16日龄后预饲1周，饲喂全价饲料(不含任何抗菌药物)。从中选取体重为0.55(0.10 kg的AA肉鸡70 只，将其随机分成两组，各35 只肉鸡，一组为空白对照组，另一组为试验组。每组设7个重复，每个重复5 只肉鸡。

1.2 标准品、药品及主要试剂 CTC、ECTC标准品：纯度分别为99 %、97 %，美国Sigma-Aldrich公司；金霉素原粉：纯度92 %，湖北武汉昌恒生物医药制品研究所；乙腈、甲醇为色谱纯，美国ROE Scientific Inc 公司；磷酸氢二钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、乙酸乙酯、三氯乙酸、甲酸均为分析纯，南京化学试剂有限公司；超纯水(本实验室自制)。

1.3 主要仪器 高效液相色谱仪(Agilent 1200，美国Agilent公司)；串联质谱仪(6410 Triple Quad，美国Agilent公司)；干浴氮吹仪(N-EVAP 112型，美国Organomation公司)；超声波振荡仪(KQ-100DE型，昆山市超声仪器有限公司)；台式高速冷冻离心机(5810R型，德国Eppendorf公司)；超纯水制备仪(Smart2Pure，美国Thermo Scientific公司)。

1.4 给药途径、剂量及样品采集 试验组鸡给药剂量按体重为50 mg/(kg·d)通过胶囊给药，每天上午8∶00～9∶00给药1次，连续5 d，给药前第1 d、给药后的第1、3、5 d和停药后第2、4、6 d，每天分别在对照组和试验组中随机选取5只肉鸡进行屠宰，取样时间均为上午8∶00～9∶00，采取肉鸡肌肉和肝脏，将样品置于-35 ℃冰箱中保存待测。

1.5 样品处理与检测方法

1.5.1 样品提取及净化 将肉鸡肌肉绞碎，准确称取3.0 g，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入12 mL 0.1 mol/L EDTA-McIIvaine提取液，充分漩涡混匀1 min，超声提取5 min后，3000 r/min离心10 min，将上清液移至另一支聚丙烯离心管中，剩余残渣重复提取2次，合并上清液， 5000 r/min离心10 min，取上清液进行肌肉样品净化。

准确称取2.0 g捣碎后混合均匀的肉鸡肝脏置于50 mL的离心管中，加入8 mL 0.1 mol/L EDTA-McIIvaine提取液后漩涡振荡10 min，以12000 r/min，5 ℃ 离心10 min，移出上清液，再以相同方式提取2 次，收集上清液并加入2 mL 5 %三氯乙酸，以12000 r/min，5 ℃ 离心10 min，取上清液进行肝脏样品净化。

HLB固相萃取小柱首先用5 mL甲醇和5 mL水活化，然后分别取上述肌肉、肝脏待净化的上清液注入该萃取小柱中，分别依次用超纯水5 mL、5%甲醇水溶液5 mL淋洗，弃去淋洗液，再用甲醇和乙酸乙酯混合溶液(v/v，1∶9)10 mL以0.5 mL/min的流速进行洗脱，洗脱液在40 ℃水浴中用氮吹仪吹干，残渣用1 mL甲醇溶解，充分混匀，残渣溶液过0.22 μm针头式过滤器后，滤液供HPLC-MS/MS测定。

1.5.2 液相色谱条件 色谱柱：Eclipse Plus C18(5 μm，2.1 mm×150 mm,id)柱；柱温：30 ℃；流速：0.35 mL/min；流动相：A：0.1 %甲酸水；B：乙腈。梯度洗脱程序为0 ～8.2 min，86.5%A；8.3～11 min，86.5%A 到2 %A；11.1 ～16 min，2 %A；16.1～20 min，2 %A 到86.5 %A；20.1～25 min，86.5%A；进样体积：5 μL。

1.5.3 质谱条件 采用电喷雾正离子模式(ESI+)和多离子反应监测模式监测；雾化气：氮气；干燥气温度：350 ℃；干燥气流速：10 L/min；雾化器压力：45 psi；毛细管电压：4000 V。金霉素和差向金霉素的保留时间和优化质谱条件见表1。

表1 金霉素和差向金霉素的保留时间和优化质谱条件

*为定量离子

1.5.4 标准曲线的建立 将质量浓度均为100 μg/mL的CTC、ECTC标准储备液分别用甲醇稀释为0.005、0.0125、0.025、0.05、0.10、0.20 μg/mL的CTC标准工作液和0.025、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 μg/mL的ECTC标准工作液。分别将CTC、ECTC标准工作液由低浓度到高浓度分别进行HPLC-MS/MS分析。每一个浓度点重复测定4次，取其平均值，分别绘制CTC、ECTC标准曲线。1.5.5 样品回收率 将空白肉鸡肌肉、肝脏样品绞碎、捣碎混合均匀，准确称取3.0 g鸡肉、2.0 g肝脏样品，分别置于50 mL聚丙烯离心管中，分别加入适宜浓度的标准工作液，使空白肉鸡肌肉样品中CTC和ECTC的浓度分别为0.05、0.10、0.15 mg/kg，空白肝脏样品中CTC和ECTC的浓度分别为0.15、0.30、0.60 mg/kg。每个添加量分别重复测定5次，样品经方法1.5.1提取和净化后，分别供HPLC-MS/MS检测，外标法定量，分别计算CTC、ECTC在空白肉鸡肌肉和肝脏中的添加回收率。

1.5.6 检测限(LOD)与定量限(LOQ)的测定 将一定浓度的CTC、ECTC标准溶液分别添加至空白肉鸡肌肉和肝脏的提取液中，用HPLC-MS/MS进行检测，并逐渐降低CTC、ECTC的浓度，以样品检测时的信噪比(S/N)为3和10分别作为方法的检测限(LOD)和定量限(LOQ)。 1.5.7 肉鸡肌肉及肝脏中CTC和代谢物ECTC的测定 按外标法，将肉鸡肌肉和肝脏中所测得的CTC和ECTC峰面积分别带入各自标准曲线，可得到肉鸡肌肉和肝脏中CTC和代谢物ECTC的残留量。

2 结果

2.1 色谱、质谱分离情况 在优化的色谱、质谱条件下进行分析，测得肉鸡肌肉、肝脏中ECTC、CTC保留时间分别为7.5 min左右和12.3 min左右，峰形对称，分离效果好。由肉鸡肌肉中CTC、ECTC总离子流色谱图(TIC)(图1)可见，空白肉鸡肌肉提取液在上述时间无干扰峰出现，且均为基线分离峰。

A. ECTC和CTC混合标准品(100ng/mL)； B.空白肉鸡肌肉提取液C. 添加CTC和ECTC标准品的空白肉鸡肌肉(0.1mg/kg)； D. 给予CTC后的肉鸡肌肉图1 肉鸡肌肉中CTC、ECTC的TIC图

2.2 标准曲线 以CTC、ECTC峰面积(y)对进样前CTC、ECTC标准工作液质量浓度(x)作图，分别得到CTC、ECTC标准曲线。CTC在0.005～0.20 μg/mL质量浓度范围内，线性回归方程为y=53382x-290.43，相关系数r=0.9935；ECTC在0.025～0.80 μg/mL质量浓度范围内，线性回归方程为y=50796x-2025，相关系数r=0.9907。

2.3 样品回收率和精密度 CTC和ECTC在肉鸡肌肉和肝脏中的回收率和精密度见表2和表3。由表2可知，在肉鸡肌肉中添加水平分别为0.05、0.1、0.15 mg/kg时，肉鸡肌肉中CTC、ECTC回收率均分别高于73.00%、81.80%，相对标准偏差均分别低于9.13%、9.29%。通过对样品精密度测定表明，CTC和ECTC在肉鸡肌肉中的日内RSD分别低于8.71%和7.66%；日间RSD分别低于12.92%和10.19%。由表3可知，在肉鸡肝脏中添加水平分别为0.15、0.30、0.60 mg/kg时，肉鸡肝脏中CTC、ECTC的回收率均分别高于67.06%、78.64%，相对标准偏差均分别低于8.88%、9.48%。通过对样品精密度测定表明，CTC和ECTC在肉鸡肝脏中的日内RSD分别低于7.38%和8.84%；日间RSD分别低于7.79%和10.91%。

表2 CTC和ECTC在肉鸡肌肉中的回收率和精密度(n=5)

表3 CTC和ECTC在肉鸡肝脏中的回收率和精密度(n=5)

2.4 灵敏度 本试验建立的检测方法实际应用发现，测得CTC和ECTC的检测限分别为5.0 μg/kg和20.0 μg/kg、定量限分别为10.0 μg/kg和30.0 μg/kg。表明该方法具有较高的灵敏度，完全能满足肉鸡肌肉、肝脏中CTC和代谢物ECTC残留检测的需要。

2.5 肉鸡肌肉和肝脏中CTC和代谢物ECTC的残留量测定 肉鸡肌肉、肝脏中CTC和代谢物ECTC的残留量分别见表4和表5。

表4 肉鸡肌肉中CTC素和代谢物ECTC残留量(n=5)

ND.低于方法检测限

表5 肉鸡肝脏中CTC和代谢物ECTC残留量(n=5)

ND.低于方法检测限

由表4可知，肉鸡肌肉中CTC和代谢物ECTC的残留量在给药后第1 d时，残留量达到154.94 μg/kg。在肉鸡肌肉中ECTC的残留量虽然低于原形药物CTC的含量，但在残留药物中也占了很大的比例。由表5可见，肉鸡肝脏中CTC和代谢物ECTC的残留量在给药后第5 d时，残留量达到178.89 μg/kg。综合表4、表5可以看出，停药后肉鸡肌肉和肝脏中CTC和ECTC代谢均缓慢，在停药后第6 d时，CTC和ECTC在肉鸡肌肉和肝脏中仍然能检出，但均低于我国和欧盟所规定的最高残留限量标准。

3 讨论

3.1 色谱和质谱条件的优化

本试验比较了流动相：0.1%甲酸水-乙腈和0.1%甲酸水-甲醇，以及固定相C8、C18分析柱来分析肉鸡组织中CTC和代谢物ECTC的分离效果。结果表明，采用乙腈-水比甲醇-水作为流动相柱压力明显降低，有利于延长泵和色谱柱的使用寿命，并且采用Eclipse Plus C18(5 μm，2.1 mm×150 mm.id)，更有利于CTC、ECTC和杂质峰的分离和分析灵敏性的提高。在国家标准《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》[7]中，在流动相中添加了含有对离子产生有抑制作用的离子修饰剂三氟乙酸，降低了分析方法的灵敏度和可靠性，而本试验采用在流动相中添加0.1%的甲酸，有利于增加离子化效率、提高灵敏度且能避免仪器性能的下降。

在串联质谱分析过程中，CTC和代谢物ECTC具有相同的分子式和碎片离子，因此它们具有相同的母离子和子离子。故试验首先采用流动注射的方式进样，CTC、ECTC标准溶液进样浓度均为1 μg/mL，采用正离子模式进行全扫描，确定CTC、ECTC的分子离子；然后在分子离子为母离子的情况下，分别对CTC、ECTC子离子进行全扫描，选取干扰小、丰度强度高的三对离子作为CTC、ECTC的定性离子，最后在多反应监测(MRM)正离子模式下，对毛细管出口电压和碰撞电压进行优化，获得了理想的效果。

3.2 金霉素残留标示物探讨 CTC在弱酸性的条件下，会转化为无抗菌活性的ECTC。当前国内对动物源性食品中CTC残留的研究与监测仅将CTC作为残留标示物，并没有将ECTC一同作为金霉素在动物体内的残留标示物，而在国外已将CTC和ECTC均作为金霉素在动物体内的残留标示物。葛云芝等[8]研究CTC在肌肉中的残留，只把CTC作为残留标示物，并没有把ECTC作为残留标示物。Arikan等[9]研究了CTC在牛粪中的降解和代谢，研究发现ECTC和异金霉素(ICTC)是牛粪中CTC的主要代谢产物；Gajda等[10]研究了动物组织中四环素类药物及其代谢产物的残留，将ECTC作为CTC的主要代谢产物。本试验以HPLC-MS/MS检测肉鸡肌肉和肝脏中CTC和代谢物ECTC的含量，研究了定量摄入CTC后，肉鸡肌肉和肝脏中CTC和代谢物ECTC的残留分布情况。研究结果表明，除在肉鸡肌肉和肝脏中检出原形药物CTC外，还能检测出代谢物ECTC，且含量较高，毒副作用增加。由于代谢物ECTC已经被欧盟确定为残留标示物，故参照欧盟规定，建议我国应将ECTC作为CTC在动物体内的残留标示物进行监测。

3.3 药物在肉鸡肌肉和肝脏中的残留分布情况 Halling等[11]研究表明：在pH<6.5环境水中，存在的降解产物主要有ECTC、EACTC、Keto-CTC等。在本试验条件下，肉鸡体内的环境主要为弱酸性，通过胶囊内服给药CTC后，除在肉鸡肌肉和肝脏中检出原形药物CTC外，其主要代谢产物ECTC也被检出，这与Halling等[11]研究结果基本一致。有关CTC在肉鸡体内的其它代谢产物还有待做进一步的研究。

匡光伟等[12]研究了CTC在鸡体内不同组织器官中的残留以及CTC在鸡粪中的降解，以40日龄湘黄鸡为试验素材，在饲料中加入CTC散剂，添加剂量为20～50 mg/kg，连续饲喂12 d，分别在停药后2、4、7、9、12、16、23、28 d对鸡进行屠宰，采集鸡肌肉、肝脏和肾脏样品，用高效液相色谱法进行检测。研究结果表明，CTC在肾脏中残留量最高、肝脏次之、肌肉最低。本试验以AA肉鸡为研究对象，通过胶囊内服给药CTC，每天给药1次连续5 d，给药剂量为50 mg/(kg·d)，给药后第1、3、5 d和停药后第2、4、6 d时，在肉鸡肌肉和肝脏中均有CTC和代谢物ECTC被检出；停药后肉鸡肝脏中CTC、ECTC残留量均高于肉鸡肌肉中的残留量，结果与报道[12]一致，主要是由肝肠循环所引起的，一部分CTC经胆汁排泄，在肠内部分被吸收而导致肉鸡肝脏中的CTC和代谢物ECTC残留量比肉鸡肌肉中的残留量要高。

4 结论

试验组肉鸡按50 mg/(kg·d)剂量内服CTC，连续5 d给药，在停药第6 d时，肉鸡肌肉和肝脏中CTC和代谢物ECTC仍能被检测到，但残留量均低于MRLs。从保障食品安全方面考虑，建议我国将CTC和ECTC均作为金霉素的残留标示物进行监控。

[1] 中华人民共和国农业部. 动物性食品中兽药最高残留限量[S].

[2] Commission Regulation(EU)No 37/2010 of 22 December 2009 on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue limits in food stuffs of animal origin[Z].

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[12]匡光伟. CTC在鸡体不同组织器官中的残留及其在鸡粪中的降解[D]. 长沙：湖南农业大学，2007.

(编辑：陈希)

Residue Distribution of Chlortetracycline and Its Metabolite 4-Epi-chlortetracycline in Broiler Chicken Muscle and Liver

GAO Qiang1,2，PANG Mao-da3，PEI Yan1,2，WANG Ran3，WANG Bo1,2，ZHANG Yang-yang1,2，XIE Kai-zhou1,2*，ZHANG Gen-xi1,2，DAI Guo-jun1,2，WANG Jin-yu1,2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou，Jiangsu225009,China;2.KeyLaboratoryforAnimalGenetic,Breeding,ReproductionandMolecularDesignofJiangsuprovince,Yangzhou，Jiangsu225009,China;3.JiangsuKeyLaboratoryofAnimal-DerivedFoodSafety,JiangsuAcademyofAgriculturalScience,Nanjing210014,China)

A study on chlortetracycline(CTC)and 4-epi-chlortetracycline(ECTC)residue distribution was conducted in broiler chicken muscle and liver .The samples were extracted using (extracting solution)and purified by Oasis HLB SPE column. Electrospray positive ion mode (ESI+)and multiple reaction monitoring(MRM)were adopted. Finally, Chlortetracycline (CTC) and 4-Epi-chlortetracycline (ECTC) in broiler chicken muscle and liver were determinated by high performance liquid chromatography coupled with tandem quadruple mass spectrometry (HPLC-MS/MS). In this method, the limits of detection (LODs) and the limits of quantitation (LOQs) of chlortetracycline were 5.0 μg/kg and 10.0 μg/kg, respectively; the LODs and LOQs of 4-Epi-chlortetracycline were 20.0 μg/kg and 30.0 μg/kg, respectively. The average recoveries in broiler chicken muscle were 73.00%～95.20% and 81.80% ～101.60%, with the relative standard deviation (RSD) of 8.85%～9.13% and 2.05%～9.29%, respectively; the average recoveries in broiler chicken liver were 67.06%～90.80% and 78.64%～106.98%, with theRSDof 2.90%～8.88% and 4.72%～9.48%, respectively. After the broiler chickens were orally administered successively chlortetracycline of 50 mg/kg of body weight one time every day for 5 d, the residues of chlortetracycline and 4-Epi-chlortetracycline in broiler chicken muscle and liver were the highest on day 1 and day 5, respectively. The residues of 4-epi-chlortetracycline in broiler chicken liver accounted for half of the total residues. The metabolism of CTC and its metabolite ECTC was slow and could still be detected 6 d after withdrawal of drugs under the limits of the maximum residues (MRLs). To guarantee food safety, this research suggested identification and monitoring CTC and ECTC as residue marker of CTC in China.

chlortetracycline; 4-epi-chlortetracycline; residue distribution; broiler chicken muscle; broiler chicken liver

国家肉鸡产业技术体系专项(CARS-42-G23)；扬州大学“新世纪人才工程”项目

2015-11-06

A

1002-1280 (2016) 01-0024-07

S859.84